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DiMaX
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
4 Messaggi |
 Inserito il - 10 ottobre 2007 : 18:58:34
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SALVE! sn una new entry, mi sto x laureare in tecniche di laboratorio biomedico, e sto preparando la tesi sulle tecniche diagnostiche su citomegalovirus (CMV). solo ke ho poco materiale ancora riguadante la western blot, potreste aiutarmi e darmi qualke dritta? (ricerca dell'anticoropo contro l'antigene pp65 ecc...)e poi una cosa: serve x ricercare gli anticorpi e nn gli antigeni? vi prego aiutatemi nn so dv sbattere la testa, su internet o trovo qlks in inglese o nn inerente al CMV.
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
 Inserito il - 10 ottobre 2007 : 20:32:37
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Ciao Dimax,
anche io sono un Tecnico di laboratorio biomedico,
ho fatto una tesi sull' elicasi di HCMV,
http://www.tlbspazio.it/index.php?q=node/127
http://www.tlbspazio.it/tesi/elicasi%20II.pdf
pp65 o UL83 lower matrix protein è una proteina della matrice,
in diagnostica l'Antigenemia, è una metodica basata sulla ricerca, nei nuclei dei leucociti del sangue periferico (dove il CMV va in latenza), della fosfoproteina strutturale pp65 di CMV (ppUL83), proteina molto abbondante e dotata di uno spiccato tropismo per il nucleo.
Il campione di sangue deve essere utilizzato con rapidità
(entro 5 ore dal prelievo) in quanto è stato dimostrato
come un ritardo comporti una riduzione, talvolta marcata
e talvolta sensibile, del numero di cellule positive.
Il metodo si basa su quattro passaggi essenziali:
1) separazione dei PMNL del sangue periferico con destrano
e preparazione dei vetrini,
2)fissazione e permeabilizzazione dei PMNL,
3) rivelazione con immunofluorescenza e
4) lettura e quantizzazione del risultato.
Perciò gli anticorpi per vedere se si è positivi o meno,
il western blot della proteina della matrice è una cosa diversa...
...nel senso che se vuoi vedere la pp65 in western blot (è la tecnica migliore) devi avere il pellet di leucociti (meglio i monociti), lisarli fare un western blot, ( gel di poliacrilammide e trasferimento su nitrocellulosa), e poi andare con l'anticorpo anti pp65 coniugato a perossidasi e poi rivelarlo.
Comunque nella mia tesi c'è scritto come si fa un w.b.
Spero di esserti stato utile
Se hai altre domande scrivi
Ciao
-Lorenzo- |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2007 : 20:40:25
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Ah, dimenticavo nella figura c'è un anticorpo secondario che è coniugato ad una molecola chemioluminescente...
...in realtà puoi decidere tu quale anticorpo secondario usare, nel senso che può essere coniugato anche ad una perossidasi o fosfatasi oppure sistema biotina avidina streptoavidina ecc.. ecc..
Comunque ricorda che il bersaglio è l'origine del segnale, perciò sciegli tu come metterlo in evidenza.
Spero di non essere stato prolisso.
Ciao!
-Lorenzo- |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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DiMaX
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
4 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 14:10:50
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ciao aureus, grazie x la risposta, ma purtroppo la mia western blot è un po diversa dalla tua, nel senso ke noi in laboratorio nn partiamo dall'elettroforesi, noi abbiamo gia un kit ke contiene delle strisce su cui andiamo a mettere direttamente il siero del pazienete, cn diversi reagenti e soluzioni di lavaggio....poi facciamo 2 incubazioni da un ora ciascuna, il tutto posto in una vasketta fatta oscillare su un oscillatore apposito. proprio ieri in lab ho preso il foglietto ke esce con il kit (genelabs diagnostics - CMV IgM BLOT 3.0), xo + ke altro spiega il procedimento e i vari passaggi. solo una cosa xo....: qui c è scritto "è possibile visualizzare gli anticorpi ke si legano specificamente alle proteine CMV mediante una serie di reazioni ke utilizzano immunoglobuline di capra anti-IgM umane coniugate con fosfatasi alcalina e substrato BCIPNBT". Ora, ke sarebbe qsta fosfatasi alcalina e il substrato BCIPNBT?qual è la loro funzione? nn mi è molto kiara... |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2007 : 21:47:19
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Sarò breve..
...le strisce che utilizzi contengono l'estratto proteico di CMV già su nitrocellulosa.
Se il paziente è positivo per CMV ha degli anticorpi IGM anti CMV (che si attaccheranno alla tua striscia con la prima incubazione(formazione dell'immunocomplesso)),
La seconda incubazione la fai con un anticorpo(ab) secondario anti human (in questo caso sono immunoglobuline di capra) che si legherà in una porzione dell' anticorpo igm umano.
L'ab secondario è coniugato con un enzima: la fosfatasi alcalina che E' UN ENZIMA!!!
Il substrato serve all'enzima trasformarlo in prodotto.
..ora non ti starò a spiegare tutti i meccanismi dell' ALP
In soldoni..
Il risultato è che avrai un precipitato rosso (prodotto) che sarà il segnale della localizzazione dell'immunocomplesso.
La funzione dell'ALP e del substrato è quello di visualizzare la positività del test.
-Il bersaglio è l'origine del segnale-
Spero di essere stato chiaro.
Se hai altre domande chiedi.
Ciao.
-Lorenzo-
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www.tlbspazio.it
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Lorenzo Nardi |
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DiMaX
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
4 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2007 : 11:05:59
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grazie Lorenzo  6 stato di grande aiuto ! ! ! ;) |
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