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Discussione |
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
 Inserito il - 17 ottobre 2007 : 15:57:22
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Qualcuno ha idea di quanto tempo l'RNA di un pellet di cellule possa conservarsi a -80 °C?
E quello già estratto?
Meglio fare l'RT al più presto e di tutto? Dalle mie parti viene fatto di volta in volta l'RT a seconda di quante sonde vogliono vedere..
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2007 : 00:21:24
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| io l'ho tenuto anche qualche mese senza avere problemi. certo l'RNA è meno stabile del cDNA, ma l'importante è misurarne la concentrazione ogni volta che lo usi. |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2007 : 13:43:31
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| Concordo dopo un mese! Personalmente preferisco stoccare il cDNA (fobie personali). Dipende moltissimo da quanto viene aperto-chiuso il freezer a -80 |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2007 : 19:55:57
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| da quel che ne so io l'RNA gia' estratto va conservato in 1/10 di sodio acetato 3M pH 5.2 e 2,5 volumi di etanolo al 95% a -20°C... |
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2007 : 20:35:29
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..figuriamoci io lo conservo in H2O RNasi free!non lo sapevo.
quindi se ho dei campioni "vecchiotti" nel -80 C non ci trovo + o quasi RNA? che ansia allora è tutto un fare RT e PCR e di corsa! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2007 : 23:23:26
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| non è detto. dipende anche da quanto abbondante è l'rna di tuo interesse. certo, se stai studiando geni espressi a bassi livelli...il consiglio è retrotrascriverli. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2007 : 17:49:41
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Citazione:
Messaggio inserito da byo_gio
da quel che ne so io l'RNA gia' estratto va conservato in 1/10 di sodio acetato 3M pH 5.2 e 2,5 volumi di etanolo al 95% a -20°C...
questo è un pessimo modo di conservazione.
Di fatti lo stato di precipitazione in alcool che procuri in questo modo fa in modo che nessun enzima o ione possa internferire con la stabilità del tuo RNA, quindi la degradazione è praticamente assente.
Tuttavia tutto questo è a scapito del grado di recuperabilità dell'RNA dopo la precipitazione.
In altre parole è meglio non far stare troppo tempo il DNA e RNA precipitato in alcool poiché si disidratano sempre di più fino ad essere irrecuperabili o inutilizzabili pur essendo integri.
Una volta disidratato il DNA o l'RNA oltre un certo livello è difficilissimo rispospenderlo senza portarsi dietro l'alcol (corrente di azoto fino a secco poi 4°C o.n. sotto lenta agitazione in TE) ed in questa fase l'RNA si può degradare.
Il metodo migliore è usare acqua milliro con un po' di DEPC degasato (0,1%) e tris-base con pH leggermente acido (ultrafiltrata) conservato in fondo ad un -80°C con un siberino vicino per evitare gli sbalzi termici ogni volta che si apre il freezer.
Se l'RNA è purificato bene può stare lì per anni senza degradarsi (anche se si trova solo a -20°C).
Se l'RNA si porta appresso anche ioni o proteine varie è tutto inutile comunque.
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2007 : 22:01:16
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wow grazie di tutte queste informazioni!
altre domanducce:
Prima di estrarre l'RNA noi conserviamo le cellule come pellet nel -80 , anche così si possono conservare, per quanto?
Una volta estratto posso scongerlarlo + di una volta per fare diversi RT, senza provocarne una degradazione? |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 00:27:30
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Citazione:
Messaggio inserito da Nica
wow grazie di tutte queste informazioni!
altre domanducce:
Prima di estrarre l'RNA noi conserviamo le cellule come pellet nel -80 , anche così si possono conservare, per quanto?
Una volta estratto posso scongerlarlo + di una volta per fare diversi RT, senza provocarne una degradazione?
Per quanto riguarda le cellule a -80°C non saprei, non l'ho mai fatto, ma considerando che per i tessuti tutto sommato va bene anche per settimane... credo che nel tuo caso si può conservare almeno per lo stesso tempo se non di più, ma non saprei dirti per quanto. Nelle cellule l'RNA è in continuo contatto con proteine e ioni che lo degradano, ed anche se sei a -80°C qualche processo funziona ancora, persino l'autodegradazione spontanea dell'RNA... Però sto solo speculando, non saprei proprio.
Per quando riguarda i cicli di congelamento e scongelamento in pratica non è mai una buona idea. Gli oligonucleotidi non durano mai più di 5-6 cicli di congelamento e scongelamento poi si degradano.
Non so a quanti cicli possa resistere un RNA estratto, ma di sicuro non più di 4-5, e devi riquantizzare ogni volta che scongeli, verificando lo stato di degradazione.
In vita mia non ho mai congelato RNA per più di una notte, l'ho sempre retrotrascritto tutto o quasi poco dopo l'estrazione, ovviamente solo se si tratta di un'ottima estrazione e poi le divido in aliquote che congelo.
Il tuo meccanismo di retrotrascrizione ogni tanto mi risulta un po' difficile da capire
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 15:14:45
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Molto spesso si mitizza questo RNA come se fosse una delicatissima bolla di sapone che basta un niente per vederla trasformarsi in aria...
Noi conserviamo anche per diversi mesi i pellet delle cellule sempre a -80, certo prima si possono processare meglio è.
L'RNA è in H2O RNAse,DNAse free ottenuta mediante una cartuccia della millipore che si collega al MILLIQ che si chiama Pirograd. Conserviamo l'RNA a -80 anche per anni. Considera che io faccio le corse per vedere la qualità dell'RNA con il Bioanalyzer dell'Agilent sempre con lo stesso controllo + che è RNA di tessuto adiposo (rognosissimo)o cellule di adipociti, ormai da 3 anni, ed i campioni sono sempre sovrapponibili e di buona qualità.
Invece è il cDNA che si degrada più facilmente, non so se a causa dell'RT o del fatto che viene conservato a -20, ma una cosa certa al 100% è che più è diluito e per meno tempo sarà stabile. Di questo ce ne siamo accorti con le diluizioni degli standard e dei campioni per le real.
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 17:14:35
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| grazie ciò mi consola! |
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nomis
Nuovo Arrivato
Città: roma
16 Messaggi |
 Inserito il - 25 ottobre 2007 : 19:15:37
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sono d'accordo con cin!!!
nelle mie mani l'RNA ben concentrato a -80.... si conserva bene per anni. per quanto riguarda le cellule io screpo direttamente la piastra in TRIZOL (no so tu con che reagente lo estrai) e lo conservo a -80 quando mi serve estraggo l'RNA(anche dopo 1 anno). ci sono in commercio delle eppendorf specifiche per lutilizza di acidi nucleici o proteine. ho fatto una verifica e permettono di perdere molto meno materiale... ma è una sciccheria!!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 02:25:17
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Citazione:
Messaggio inserito da cin
Invece è il cDNA che si degrada più facilmente, non so se a causa dell'RT o del fatto che viene conservato a -20, ....
Cin meno male che lo dici anche tu... mi consola!!!  Anch'io uso per mesi e a volte anni gli stessi RNA e funzionano benissimo... mentre il cDNA mi si degrada e dopo poco non funziona più... pensavo di essere "anormale" io! Tutti dicono il contrario!!!
Comunque io ultimamente tengo sia cDNA che RNA a -30°C, ma per un motivo pratico... nel -80°C ci mettono le mani tutti... e spostano anche le cose altrui ... mentre il -30°C è MIO!!! E il mio RNA sta bello tranquillo ed è meno soggetto a sbalzi termici! |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 09:14:10
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Eh sì GFPina, lo sbalzo termico..... dire fondamentale è dire poco! Una volta congelate siano esse cellule o RNA non le tiriamo più fuori fino al momento del processamento.
Come al solito si cerca di fare tutto nel più breve tempo possibile, nel senso che solitamente se so di estrarre, poi retrotrascrivo subito( a meno che non ci siano imprevisti). Le ragazze che fanno colture cellulari mettono nel pellet il buffer di lisi e condervazione per l'RNA:RLT della QIAGEN. Poi mettono a -80 e lì resta anche per un anno fino a che non si decide di estrarne l'RNA. Noi estraiamo con le colonnine della Qiagen, quantifichiamo,ne vediamo la qualità, trattiamo con DNAse della Ambion,retrorascriviamo. Il cDNA concentrato lo teniamo a -20, mentre diluiamo i campioni il meno possibile in modo da gettare dopo l'utilizzo le aliquote diluite.
Per nomis:
non ho capito cosa sono le eppendorf specifiche che fanno cosa? |
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conservazione dell'RNA
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