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stefy83
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Milano
4 Messaggi |
 Inserito il - 20 ottobre 2007 : 13:04:18
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Ciao a tutti, mi chiamo stefania e studio biologia. Mi chiedevo: è possibile aggiungere ad un lisato cellulare una fosfatasi per defosforilare una proteina prima di correrla su gel SDS-page?? [/size=2][/size=3]
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 13:20:59
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| Sinceramente non so proprio...ma penso che per vedere una proteina defosforilata basta non aggiungere al tampone di lisi gli inibitori delle fosfatasi (es. PMSF) in modo da non bloccare le fosfatasi endogene presenti nel lisato... |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 16:34:55
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Pienamente d'accordo, purchè esista una chinasi endogena in quantità sufficiente,
ATP in quantità sufficiente, e una specificità sufficiente da parte della suddetta
chinasi. Tutte queste cose sono limitanti. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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stefy83
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Milano
4 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 19:22:17
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Grazie...
Quindi non è possibile che la doppia banda che il mio anticorpo riconosce sul mio western blot sia l'isoforma fosforilata della mia proteina? |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 20:12:54
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Beh...potrebbe anche essere (dipende sempre dalla presenza o meno di inibitori delle fosfatasi)...oppure potrebbe essere una modificazione post-traduzionale della proteina in questione...alcune proteine corrono come doppietti in lisati totali...
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A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2007 : 23:17:01
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La cosa più veloce per risolvere quel dubbio sarebbe provare con un anticorpo specifico per la forma fosforilata.
Nel caso di un doppietto io andrei prima a pensare a possibili aggregati della proteina. Che proteina è e che peso hanno le due bande? |
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stefy83
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Milano
4 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2007 : 10:47:33
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Purtroppo non ho un anticorpo per la forma fosforilata, e in realtà non credo che esista, nessuno ha mai ipotizzato che questa proteina possa essere fosforilata, per cui dovrei togliermi questa "curiosità" con i mezzi che ho! E' una proteina di membrana e a mio avviso le due bande sono troppo vicine per essere degli aggregati (mi aspetterei che un aggregato avesse almeno un peso molecoare doppio rispetto al monomero...)
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
La cosa più veloce per risolvere quel dubbio sarebbe provare con un anticorpo specifico per la forma fosforilata.
Nel caso di un doppietto io andrei prima a pensare a possibili aggregati della proteina. Che proteina è e che peso hanno le due bande?
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2007 : 13:57:21
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Non può essere un precursore? Oppure una forma modificata della tua proteina (magari mantenuta nel reticolo endoplasmatico e non ancora portata in membrana)...ancora non potrebbe essere ubiquitinata???
Sono solo ipotesi... |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2007 : 14:05:02
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Comunque se ti vuoi togliere la curiosità di andare a vedere se la tua proteina è fosforilata...puoi immunoprecipitare la tua proteina in estratto totale e fare un WB utilizzando un anticorpo, ad esempio, anti fosfo-Tyr (se può essere fosforilato in Tyr)...
Nello stesso modo, decorando poi la membrana con l'anticorpo specifico per la tua proteina riesci a vedere se hai IP entrambe le bande...nel caso tu abbia IP solo una banda...beh, probabilmente l'altra banda è aspecifica...
Ciao
Luca |
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stefy83
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Milano
4 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2007 : 14:12:06
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si, potrebbe essere ognuna di queste cose...
Magari proverò un anticorpo antifosfotirosina.
Grazie.
ciao
Citazione:
Messaggio inserito da Luca-DNA
Comunque se ti vuoi togliere la curiosità di andare a vedere se la tua proteina è fosforilata...puoi immunoprecipitare la tua proteina in estratto totale e fare un WB utilizzando un anticorpo, ad esempio, anti fosfo-Tyr (se può essere fosforilato in Tyr)...
Nello stesso modo, decorando poi la membrana con l'anticorpo specifico per la tua proteina riesci a vedere se hai IP entrambe le bande...nel caso tu abbia IP solo una banda...beh, probabilmente l'altra banda è aspecifica...
Ciao
Luca
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