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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
 Inserito il - 23 ottobre 2007 : 15:26:50
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ciao ragazzi ho staccato delle cellule da un tessuto ma in piastra invece di avere cellule epiteliali ho trovato solo tantissimi globuli rossi e direi quasi nulla delle cellule epiteliali ke volevo...Come mai? inoltre ora devo togliere i globuli rossi esiste una tecnica? grazie mille elisa
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 00:45:00
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Che procedura usi per prelevare le cellule? Un preventivo lavaggio del tessuto in PBS potrebbe bastare.
Ad ogni modo visto che i globuli rossi non si duplicano il problema sta nella bassa quantità di epitelio prelevata direi. |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 09:25:31
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ciao grazie x la risp...io uso la biopsia ma devo staccare celluylen nasali nn globuli rossi invece ci sono solo globuli rossi...volevo chiederti una cosa se possibili...su di un protocollo ho letto questa procedura...il tessuto è stato messo in 4 ml di soluzione contenente 0.5% pronasi in EBSS /earls balanced salt solution) a 4 c per 16/20 ore quindi circa over night.....se invece dell'ebss usassi il pbs cn dentro la tripsina +edta (al posto di pronasi) va bene lo stesso?
Inoltrre scusa io ho già soluzione di tripsina allo 0.5% di concentrazione se devo metterne 0.5% li calcolo sui 4 ml giusto? cioè faccio o.5%*4/0.5=4 però sn 4 ml o 4 ul mi sembra troppo 4 ml di tripsina in 4 ml di terreno no? inoltre sul rpotocollo c'è scritto 0.5% (w/v) ke significa ciò ke c'è nella parentesi? grazie mille |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 13:11:42
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Allora, premetto che non ho mai preso cellule nasali quindi non conosco le specifiche problematiche del caso.
Usare PBS invece di EBSS non dovrebbe fare moltissima differenza. La tripsina invece della pronasi potrebbe invece fare molta differenza. La tripsina è piuttosto "forte" come proteasi, quindi le tue cellule potrebbero venire molto danneggiate dopo 16 ore in tripsina. Non ho mai usato la pronasi, ma io per le mie colture primarie neuronali ho avuto un netto miglioramento sostituendo la tripsina con papaina (37° per ~30 minuti, possibilmente con leggera agitazione).
Quella concentrazione di 0.5% è intesa nel volume del terreno, quindi su 4 ml hai 0.05*4ml=0.2ml=200ul (attenzione che 0.5%=0.05, non 0.5!!!!)
w/v significa peso su volume, quindi 0.5% (w/v) vuol dire 0.5g per 100 ml (partendo da tripsina in polvere)
Se vuoi continuare con la tripsina ti consiglierei di provare:
1) 37° per breve tempo (10-20 min), magari seguito da dissociazione meccanica (es. passando il tutto in un puntale da P1000)
2) o/n a 4° con una minore concentrazione di tripsina |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 14:42:34
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| infatti anke a me sembra troppo la volta scorsa ho usato 75 ul di tripsina la cui concentrazione era 0.5% in v finale di 1.5 ml è troppo vero over night? ora ho acquistato una tripsina ke consiglia x cellule nasali 0.025% tripsina+o.1% edta quindi totale o.o35% cosa faccio lo calcolo in 4 ml ad es quindi metto 0.0014 cioè 1.4 ul in tot di 4 ml di terreno ad over night? |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 14:45:36
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| scusa è 0.01% edta nn 0.1% ho sbagliato a scrivere |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 14:46:56
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trips 0.025% edta 0.01% in volume 100 ml la confezione è...ora ho scritto giusto |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 15:14:39
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| ho controllato bene sulla confezione c'è scritto soluzione tripsina edta 0.25 mg/ml volume 100ml. Poi se ne consiglia di kmettere 0.025% tripsina e+0.01% edta quindi tot 0.035%. Se il volume finale del mio terreno è 4 ml cosa faccio? 0.035*4=0.0014 quindi 1.4 ul? o evo fare qualke proporzione tenendo conto anke di 0.25 mg e v 100 ml? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 04:13:20
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| Guarda, la realtà è che in questi casi l'unica soluzione è provare con diverse concentrazioni, tempi e temperature sempre cambiando un solo parametro alla volta, fino ad ottimizzare la procedura. Piccoli cambiamenti possono dare risultati molto diversi. |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 11:35:32
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| Come dice Chick i globuli rossi tenderanno a morire e a sparire dalla tua coltura...parlando con la mia collega superesperta in colture cellulari mi deicva che troppi globuli rossi potrebbero soffocare le tue cellule ed impedirne totalmente la crescita...inoltre per mia esperienza lascia tranquilla la coltura...magari le cellule ci sono ma non sei riuscita a vederle... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 11:49:13
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| effettivamnte qualke cellulina c'è però cm faccio a separare i globuli rossi? |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 14:39:58
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i globuli muoino in linea di massima...anche perchè, come diceva chick, sono anucleati e non si duplicano! Prova a lavare la fiasca con del PBS un paio di volte, ovviamente dolcemente per evitare di staccare le tre cellule che ti interessano dalla piastra, buttagli del terreno fresco e lascia stare tutto per almeno un paio di giorni!
Non le toccare, non le agitare, controlla solo che non siano inquinate e che almeno quelle tre solitarie stiano bene! Dagli il tempo!!!
Se non avessimo avuto pazienza a quest'ora col cavolo che saremmo a fare lo studio della biopsia di un'autopsia...
Lavorare con le cellule è una questione di pazienza...sono loro a regolare i tuoi ritmi, non tu i loro...(in linea di massima...ovviamente non mi riferisco a esperimenti di induzione)
Devi essere paziente! |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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globuli rossi e nn cellule epiteliali
Didattica e Relazioni
