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alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
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26 Messaggi |
 Inserito il - 29 ottobre 2007 : 19:52:39
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Salve a tutti ho un problema grosso!!per estrarre le proteine da cellule eucariotiche utilizzo il classico RIPA buffer (con Tris-Hcl, NaCl, TritonX100, SDS, EDTA, PMSF e inibitori delle proteasi). Partendo da pellet cellulari conservati a -80°C tuttavia le rese sono basse. Qualcuno sa dirmi da quante cellule dovrei partire e le rese teoriche che dovrei ottenere?please sn disperata!!!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 23:23:16
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Non so che intendi per "resa proteica accettabile"... dipende dal tipo cellulare, dalla confluenza e da quante piastre estrai.
Per esempio mi basta una piastra da 10 cm ricche di cellule PC12 per avere abbastanza estratto proteico totale per i miei esperimenti, mentre se uso le SHSY devo usare una decina di piastre dello stesso tipo per avere una quantità simile.
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 23:36:30
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in linea di massima la resa di estrazione che hai con pellet congelati è sempre un po' più bassa rispetto a quella che ottieni con cellule "fresche".
Oltre a concordare con neuroscience su cellule (esitono buffer appropriati a seconda del tipo cellulare), confluenza e n° piastre, potrebbe dipendere anche dal tempo che impieghi per fare l'estrazione, cioè magari fai agire il RIPA per troppo poco tempo.
che cellule usi?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
Città: catania
26 Messaggi |
 Inserito il - 30 ottobre 2007 : 12:22:57
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Utilizzo linee di neuroblastoma (Sk-N-BE e SH-Sy5y) che coltivo in fiasche da 25 cm2 e pelletto a confluenza.Il Ripa agisce per mezz'ora in ghiaccio.dopo centrifugo a 10000 rpm per 15 min. Quanto ripa dovrei mettere secondo te?
Citazione:
Messaggio inserito da Iside
in linea di massima la resa di estrazione che hai con pellet congelati è sempre un po' più bassa rispetto a quella che ottieni con cellule "fresche".
Oltre a concordare con neuroscience su cellule (esitono buffer appropriati a seconda del tipo cellulare), confluenza e n° piastre, potrebbe dipendere anche dal tempo che impieghi per fare l'estrazione, cioè magari fai agire il RIPA per troppo poco tempo.
che cellule usi?
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alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
Città: catania
26 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2007 : 12:27:20
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Anche io uso le SY5Y ma uso le fiaschette da 25 cm2. Quanti microgrammi circa di proteina estrai? in che volume?Usi il RIPA?
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Messaggio inserito da Neuroscience
Non so che intendi per "resa proteica accettabile"... dipende dal tipo cellulare, dalla confluenza e da quante piastre estrai.
Per esempio mi basta una piastra da 10 cm ricche di cellule PC12 per avere abbastanza estratto proteico totale per i miei esperimenti, mentre se uso le SHSY devo usare una decina di piastre dello stesso tipo per avere una quantità simile.
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2007 : 14:30:26
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Messaggio inserito da alexct82
Utilizzo linee di neuroblastoma (Sk-N-BE e SH-Sy5y) che coltivo in fiasche da 25 cm2 e pelletto a confluenza.Il Ripa agisce per mezz'ora in ghiaccio.dopo centrifugo a 10000 rpm per 15 min. Quanto ripa dovrei mettere secondo te?
allora, premetto che non ho mai lavorato con queste linee, per quanto riguarda il RIPA io lo lascio agire per 30 minuti in camera fredda in continua agitazione, e poi centrifugo a 14.000rpm per altri 30 minuti. |
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alexct82
Nuovo Arrivato
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 Inserito il - 30 ottobre 2007 : 17:56:08
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ok grazie mille!!!
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Messaggio inserito da Iside
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Messaggio inserito da alexct82
Utilizzo linee di neuroblastoma (Sk-N-BE e SH-Sy5y) che coltivo in fiasche da 25 cm2 e pelletto a confluenza.Il Ripa agisce per mezz'ora in ghiaccio.dopo centrifugo a 10000 rpm per 15 min. Quanto ripa dovrei mettere secondo te?
allora, premetto che non ho mai lavorato con queste linee, per quanto riguarda il RIPA io lo lascio agire per 30 minuti in camera fredda in continua agitazione, e poi centrifugo a 14.000rpm per altri 30 minuti.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 00:55:29
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25 cm2 per le SH ?
bhé praticamente parli di nanogrammi di proteine...
per avere 80 microgrammi io devo fare circa 7 piastroni da 15 (o 20?)cm di diametro ognuna con piena confluenza di cellule, ogni esperimento per me è una mazzata. Nel tuo caso se arrivi a 2-3 microgrammi di estratto proteico ti puoi considerare fortunato.
Non uso il RIPA, uso un buffer lysis che faccio io con varie sostanze, tra cui SDS, triton, vanadato di sodio, fosftato, hepes ed ovviamente il cocktail di inibitori delle proteasi.
L'estratto proteico è totale, praticamente liso le cellule o tessuti, centrifugo un paio di volte per 2 soluzioni.
Non sono mai riuscito a risolvere la scarsa resa delle SH-SY 5Y, tanti miei amici hanno lo stesso problema, quindi immagino che il problema sia proprio delle cellule non nel metodo di estrazione.
Le PC12 che sono cellule molto più piccole e composte dal 90% dal nucleo cellulare hanno una montagna di RNA e proteina, mi basta una piastra da 10 cm per arrivare già a 80 microgrammi ed a volte anche di più. Per il tessuto non ne parliamo proprio, basta mezzo ippocampo di un topo (grandezza pari a quella di una virgola di un libro medio) per raggiugere centinaia di microgrammi di estratto proteico.
Se trovi un protocollo di estrazione più efficiente per le SH fammelo sapere che sono molto interessato
Citazione:
Messaggio inserito da alexct82
Anche io uso le SY5Y ma uso le fiaschette da 25 cm2. Quanti microgrammi circa di proteina estrai? in che volume?Usi il RIPA?
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Messaggio inserito da Neuroscience
Non so che intendi per "resa proteica accettabile"... dipende dal tipo cellulare, dalla confluenza e da quante piastre estrai.
Per esempio mi basta una piastra da 10 cm ricche di cellule PC12 per avere abbastanza estratto proteico totale per i miei esperimenti, mentre se uso le SHSY devo usare una decina di piastre dello stesso tipo per avere una quantità simile.
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alexct82
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Inserito il - 31 ottobre 2007 : 13:57:03
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ok, allora proverò con le fische da 75 perchè in lab ho solo queste.
Il problema cmq non è tanto la massa totale chè è buona (circa 250 microgrammi da una fiaschetta da 25) ma la concentrazione che è bassa perche per lisare uso 250 microlitri di RIPA e quindi ho un Conc Finale di proteina di 1 microgrammo su microlitro. Ho provato a precipitare con TCA ma è venuto fuori un TAPPO di proteine conpletamente insolubile in sample buffer (anche lasciato una notte a 60 gradi non si è sciolto!!!!).tu che concentrazione finale ottieni con il tuo buffer?
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Messaggio inserito da Neuroscience
25 cm2 per le SH ?
bhé praticamente parli di nanogrammi di proteine...
per avere 80 microgrammi io devo fare circa 7 piastroni da 15 (o 20?)cm di diametro ognuna con piena confluenza di cellule, ogni esperimento per me è una mazzata. Nel tuo caso se arrivi a 2-3 microgrammi di estratto proteico ti puoi considerare fortunato.
Non uso il RIPA, uso un buffer lysis che faccio io con varie sostanze, tra cui SDS, triton, vanadato di sodio, fosftato, hepes ed ovviamente il cocktail di inibitori delle proteasi.
L'estratto proteico è totale, praticamente liso le cellule o tessuti, centrifugo un paio di volte per 2 soluzioni.
Non sono mai riuscito a risolvere la scarsa resa delle SH-SY 5Y, tanti miei amici hanno lo stesso problema, quindi immagino che il problema sia proprio delle cellule non nel metodo di estrazione.
Le PC12 che sono cellule molto più piccole e composte dal 90% dal nucleo cellulare hanno una montagna di RNA e proteina, mi basta una piastra da 10 cm per arrivare già a 80 microgrammi ed a volte anche di più. Per il tessuto non ne parliamo proprio, basta mezzo ippocampo di un topo (grandezza pari a quella di una virgola di un libro medio) per raggiugere centinaia di microgrammi di estratto proteico.
Se trovi un protocollo di estrazione più efficiente per le SH fammelo sapere che sono molto interessato
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Messaggio inserito da alexct82
Anche io uso le SY5Y ma uso le fiaschette da 25 cm2. Quanti microgrammi circa di proteina estrai? in che volume?Usi il RIPA?
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Non so che intendi per "resa proteica accettabile"... dipende dal tipo cellulare, dalla confluenza e da quante piastre estrai.
Per esempio mi basta una piastra da 10 cm ricche di cellule PC12 per avere abbastanza estratto proteico totale per i miei esperimenti, mentre se uso le SHSY devo usare una decina di piastre dello stesso tipo per avere una quantità simile.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 12:31:28
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in genere sopra i 5 microgrammi per microlitro e carico circa 6 microlitri per pozzetto.
Sei sicuro che si tratta di proteine purificate? La tua mi pare una quantità esagerata anche per le PC12
Per concentrare hai provato la SpeedVac? ovvero centrifugazione sottovuoto per concentrare. In genere se non ci sono troppi sali va bene.
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alexct82
Nuovo Arrivato
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Città: catania
26 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2007 : 13:48:34
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No le rese di cui t parlavo erano per le SHSY5Y!non sono proteine purificate però!essendo così diluite devo caricare il massimo (cioè 15 microlitri per pozzetto) e spesso le bande della beta actina sono debolissime!!!non oso pensare se dovessi usare un anticorpo per una proteina rara!!
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Messaggio inserito da Neuroscience
in genere sopra i 5 microgrammi per microlitro e carico circa 6 microlitri per pozzetto.
Sei sicuro che si tratta di proteine purificate? La tua mi pare una quantità esagerata anche per le PC12
Per concentrare hai provato la SpeedVac? ovvero centrifugazione sottovuoto per concentrare. In genere se non ci sono troppi sali va bene.
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