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fabio
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 13:49:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fabio Invia a fabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
dopo numerosi tentativi di purificazione mediante cromatografia per affinità con nichel (His-Tag) non riesco ad ottenere una purificazione omogenea anche se il livello di espressione di questa proteina è molto alta. Ho provato ad aumentare il NaCl (da 300mM consigliato sino a 500 mM nei buffer di lavaggio ed eluizione)ed aumentare l'imidazolo a 30 mM nel lavaggio (contro i 10-20mM raccomandati dai produttori). Ottengo una buona resa ma con la presenza di contaminanti. Se qualcuno ha più esperienza di me per quanto riguarda questo tipo di cromatografia per favore mi aiuti. Devo aumentare ancora la concentrazione di sale o imidazolo nei lavaggi? qualcuno mi saprebbe dire fino a che percentuale di purezza è possibile ottenere con questo tipo di cromatografia?
Ciao e grazie per l'attenzione.

tommasomoro
Utente Junior



358 Messaggi
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 14:16:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tommasomoro Invia a tommasomoro un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quanti lavaggi fai

c'e' imidazolo nel loading buffer

lavi con gradiente di imidazolo o a step crescenti quanti ne fai

puoi sempre usare un'ulteriore colonna dopo

T.
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MaryngA
Nuovo Arrivato


Prov.: Parma
Città: Parma


29 Messaggi
Inserito il - 02 novembre 2007 : 16:56:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryngA Invia a MaryngA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anke a me è capitato e in questi casi ho sottoposto l'eluato proteico ad una seconda cromatografia questa volta con una colonna a scambio anionico forte lavorando ad un pH in cui i gruppi polari della proteina d'interesse fossero deprotonati. Prima xò devi scambiare il solvente del campione proteico per eliminare i residui di sale.
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là
Utente Junior



565 Messaggi
Inserito il - 03 novembre 2007 : 14:25:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! io uso nel buffer di eluizione una concentrazione finale di imidazolo di 500 mM. E se ci sono contaminanti faccio un passaggio con la mono Q, che è una colonna a scambio cationico o anionico, scusami ma non ricordo al momento; lunedi' saro' piu' precisa!
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là
Utente Junior



565 Messaggi
Inserito il - 03 novembre 2007 : 14:31:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
pro' spesso dopo un primo passaggio con la colonna nichel ne faccio un altro sempre con questa colonna. hai provato? perchjè mi sono accorta che spesso pulisce abbastanza dai contaminanti.
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fabio
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 06 novembre 2007 : 11:58:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fabio Invia a fabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si ho provato con una ulteriore cromatografia a scambio anionico via HPLC ma purtoppo ho ancora la presenza di contaminanti di un peso molecolare più basso e temo che questi non siano contaminanti ma la stessa proteina degradata. potrebbe essere?
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là
Utente Junior



565 Messaggi
Inserito il - 06 novembre 2007 : 16:12:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si si potrebbe essere. Mi era successo poco tempo fa. cio' che ho fatto è una nuova lisi aggiungendo il cocktail di inibitori delle proteasi, e cosi' ho risolto il problema.
Se pero' lo avevi già messo l'unica secondo me è rifare tutto da capo. Se invece è un contaminante potresti fare una dialisi e poi rifare la purificazione
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fabio
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 08 novembre 2007 : 15:45:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fabio Invia a fabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Penso proprio di rifare tutto riprovando magari ad aumentare la concentrazione dei sali (1M) e di imidazolo (50mM) nel lavaggio. Grazie
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là
Utente Junior



565 Messaggi
Inserito il - 12 novembre 2007 : 17:49:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di là Invia a là un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il mio tampone di eluizione è questo:

tris HCl 25mM finale
NaCl 50mM finale
glicerolo 50% finale
imidazolo o.5M finale

nel caso tu volessi provere!
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fabio
Nuovo Arrivato



29 Messaggi
Inserito il - 15 novembre 2007 : 18:36:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fabio Invia a fabio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie Laura, ma non capisco la funzione del glicerolo.
potrebbe aiutarmi a ridurre i contaminati?
utilizzavi colonnine di Nickel preimpaccate?
il tampone di lavaggio è lo stesso ma senza (o a conc.minore) imidazolo?
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