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nyo84
Utente Junior


Prov.: Brescia
Città: Piancogno


239 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2007 : 12:10:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nyo84 Invia a nyo84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!qualcuno saprebbe dirmi dove posso trovare un buon protocollo per questa tecnica?ne ho trovati alcuni in letteratura,ma tutti abb diversi tra di loro e quindi non so a quale fare riferimento..devo fare esperimenti su cell umane andando a vedere cosa lega NF-kB.grazie!

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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6941 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2007 : 14:08:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
andando a vedere cosa lega NF-kB? Stai fresca, legherebbe tutto il mondo, se fosse fatto di DNA... Il protocollo prob si trova, ma il problema è un altro: devi settare i cicli di sonicazione a seconda della lunghezza che vuoi nei frammenti, e quello lo fai in due fasi: facendotene un'idea leggendo qualche articolo con una ricerca simile e provando. Io ne ho seguito uno, ad esempio, dove a penna ho fatto delle correzioni perché ho visto che era più efficiente per le mie esigenze.

Il suggerimento è: prendine uno (da un articolo o da un sito) e provalo. Purtroppo è una procedura noiosa e rognosa, soprattutto il primo giorno, però non credo si possa fare molto più di così.

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nyo84
Utente Junior


Prov.: Brescia
Città: Piancogno


239 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2007 : 11:25:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nyo84 Invia a nyo84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io pensavo di fare l'immunoprecipitazione e poi fare una RT-PCR per vedere se lega il mio gene d'interesse...

Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
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Giuliano652
Moderatore

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Prov.: Brescia


6941 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2007 : 13:35:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Giuliano652 Invia a Giuliano652 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e quello si deve fare!

Hai letto un protocollo? Fissazione, estrazione nuclei, sonicazione per frammentare il DNA, immunoprecipitazione, PRC con i primer del frammento d'interesse e corsa sul gel. Tra tutto questo c'è almeno due-tre giorni di lavoro, e il settaggio della sonicazione dipende molto dalla lunghezza dei frammenti che puoi avere: puoi settare il numero di impulsi ultrasonici, la frequenza degli ultrasuoni e anche la loro durata. Per tutto ciò il protocollo ti darà delle linee guida, ma per il tuo esperimento specifico dovrai quasi sicuramente cambiare qualcosa.

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