| Autore |
Discussione |
|
|
Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
 Inserito il - 17 novembre 2007 : 09:59:19
|
Salve a tutti...avrei alcune domande da fare...allor la prima è:
-appena abbiamo caricato il resolving gel che sostanza dobbiamo mettere subito x impedire all'ossigeno di entrare ad impedire la polimerizzazionex poi versare lo stacking?(alcuni dicono h2o, alcuni isopropanolo o butanolo)...
-il running buffer si versa sia dove sono i pozzetti e sia fuori giusto?ma perchè si mette anche fuori?c'è qualche collegamento tra le 2 camerette elettroforetiche?grazie!
PS:potete spiegarmi come funzionano il transito di ioni quando applico la corrente(glicinato cl ecc)??grazie di nuovo
|
Davide* |
|
|
|
|
MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 11:20:27
|
Io ti so solo dire rispondendo alla prima domanda ho sempre usato ISOPROPANOLO!
Ciao ciao |
 |
|
|
coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 12:24:06
|
Io utilizzo acqua bidistillata!
|
|
|
|
moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 12:27:08
|
Citazione:
Messaggio inserito da Biotecnologo1987
Salve a tutti...avrei alcune domande da fare...allor la prima è:
-appena abbiamo caricato il resolving gel che sostanza dobbiamo mettere subito x impedire all'ossigeno di entrare ad impedire la polimerizzazionex poi versare lo stacking?(alcuni dicono h2o, alcuni isopropanolo o butanolo)...
-il running buffer si versa sia dove sono i pozzetti e sia fuori giusto?ma perchè si mette anche fuori?c'è qualche collegamento tra le 2 camerette elettroforetiche?grazie!
PS:potete spiegarmi come funzionano il transito di ioni quando applico la corrente(glicinato cl ecc)??grazie di nuovo
IO uso semplicemte etanolo...ma non per non far entrare ossigeno ma per "appiattire" il resolving ed eliminare eventuali bolle superficiali,Quando il resolving è poilmerizzato asciugo l'etanolo e colo lo stacking.All'aria l'acrilammide polimerizza, non ho mai sentito che l'ossigeno ne impedisca la polimerizzazione...se hai meso temed e APS, tempo pochi minuti e avrai il tuo gel!
Credo che le due camere non siano collegate ma potrebbero esserci delle perdit che ti fanno abbassre il livello del tampone, per questo se ne mette anche fuori.
Non so se ho scritto cavolate, ma questa è la mia esperienza |
|
|
|
Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 15:43:45
|
| grazie x le risposte...può darsi ke ho confuso io qualcosa...cmq grazie mille a tutti... |
Davide* |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 16:34:20
|
Si può usare sia acqua che alcool (etanolo, butanolo...) serve per evitare che ci siano bolle e permette di avere una superficie liscia uniforme, l'acqua un po' si mischia con l'acrilamide l'alcool no ma poi va sciacquato bene con acqua. (alcuni addirittura degasano le soluzioni dei gel!)
Il buffer fuori è necessario per formare il campo elettrico... se non non migra niente!
Qua è spiegato come funziona la migrazione in SDS-PAGE:
HOW DOES AN SDS PAGE GEL REALLY WORK? |
|
|
|
alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
Città: catania
26 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 16:44:11
|
| io uso l'isopropanolo...appiattisce il gel perchè è più pesante dell'acqua.poi appena il resolving polimerizza butto l'isopropanolo, sciaquo cn acua bidistillata e colo lo stacking.il running si mette in tutte e 2 le camerette ed è il gel stesso che fa da ponte... |
|
|
|
Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 12:06:13
|
| grazie mille anche a voi... |
Davide* |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 14:15:41
|
anche io uso l'etanolo (al 20%), poi lavo con tric HCl 6.8M (per capirci, quello che si usa per preparare lo stacking) e colo lo stacking.
Citazione:
Messaggio inserito da moonycinzia
All'aria l'acrilammide polimerizza, non ho mai sentito che l'ossigeno ne impedisca la polimerizzazione
in realtà è vero che l'ossigeno rallenta la polimerizzazione, tant'è che se leggi il protocolo biorad ti consiglia di filtrare l'acrilammide e di degassare la soluzione prima di metterci il temed o l'APS. io per un po' l'ho fatto, ma ci vuole almeno un quarto d'ora per degassare ogni gel e quindi per evitare di perdere tempo salto la procedura. in ogni caso l'unica differenza è che degassando il gel polimerizza un po' prima.
per quanto riguarda il running, quoto GFPina, cioè tu versi il tampone in tutta la camera per avere un sistema chiuso nel quale passano gli ioni e quindi la corrente. infatti, se tu dovessi correre un solo gel, devi montare anche l'altro supporto vuoto, proprio per creare un sistema chiuso.
già che siamo in tema, faccio una domanda anche io: voi correte il gel a vuoto prima di caricare i campioni(da me la chiamano pre-corsa)?
a cosa serve? vantaggi e svantaggi?
thanx.
 |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 16:14:31
|
grazie iside...infatti mi sono trovato un pò spiazzato x il fatto dell'ossigeno...sottrae i radicali liberi persolfato generati dall'attacco nucleofilo su 1 N del temed con l'ammonio persolfato...
x quanto riguarda la tua novità io non la faccio la precorsa non penso sia indispensabile...poi non so..ciao ciao e...grazieeee!!! |
Davide* |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 17:13:42
|
Io la pre-corsa non l'ho mai fatta!
Non so se serve!
|
|
|
|
Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2007 : 16:19:06
|
ciao,
io sopra il running gel metto semplice acqua bidistillata che ha la semplice funzione di eliminare eventuali bolle e di uniformare il gel (intendo avere un fronte alla stessa altezza). Quando il gel è polimerizzato la tolgo semplicemente capovolgendo il supporto e asciugo bene con dei pezzettini di carta 3MM appena prima di colare lo stacking gel.
Per quanto riguarda il running buffer, andrebbe bene anche metterlo tra le due camere (l'apparecchio montato ha due possibili alloggiamenti per il gel, separati da una camera centrale) perchè l'importante è che permetta il passaggio di corrente, in genere lo si mette in tutta la scatola per maggiore sicurezza, o come facevo io per evitare problemi di corsa dato che l'apparecchio che usavo io era un po' rotto!!!
Per quanto riguarda la precorsa io non l'ho mai mai fatta e nessuno che conosco la fa, nonostante questo i gel vengono bene!!! ciao a tutti
|
|
|
|
moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 11:44:25
|
Citazione:
Messaggio inserito da Iside
anche io uso l'etanolo (al 20%), poi lavo con tric HCl 6.8M (per capirci, quello che si usa per preparare lo stacking) e colo lo stacking.
Citazione:
Messaggio inserito da moonycinzia
All'aria l'acrilammide polimerizza, non ho mai sentito che l'ossigeno ne impedisca la polimerizzazione
in realtà è vero che l'ossigeno rallenta la polimerizzazione, tant'è che se leggi il protocolo biorad ti consiglia di filtrare l'acrilammide e di degassare la soluzione prima di metterci il temed o l'APS. io per un po' l'ho fatto, ma ci vuole almeno un quarto d'ora per degassare ogni gel e quindi per evitare di perdere tempo salto la procedura. in ogni caso l'unica differenza è che degassando il gel polimerizza un po' prima.
per quanto riguarda il running, quoto GFPina, cioè tu versi il tampone in tutta la camera per avere un sistema chiuso nel quale passano gli ioni e quindi la corrente. infatti, se tu dovessi correre un solo gel, devi montare anche l'altro supporto vuoto, proprio per creare un sistema chiuso.
già che siamo in tema, faccio una domanda anche io: voi correte il gel a vuoto prima di caricare i campioni(da me la chiamano pre-corsa)?
a cosa serve? vantaggi e svantaggi?
thanx.
Questo forum è meraviglioso, si impara sempre tantissimo. Buono a sapersi che l'ossigeno rallenta la polimerizzazione...ma forse dipende anche dalla percentuale. I miei gel al 10% o al 15% in 15 minuti sono già polimerizzati senza degassare nè usare altri accorgimenti di varia natura.Terrò presente qeste indicazioni per quanto faccio gel più grandi denaturanti per il DNA ( che spesso invece qualche problema me lo danno). |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 13:23:35
|
Citazione:
Messaggio inserito da moonycinzia
Questo forum è meraviglioso, si impara sempre tantissimo.
Lo puoi dire forte  |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
| |
Discussione |
|
SDS-PAGE
Didattica
