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BIOmartina
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 18 novembre 2007 : 13:04:24
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CIAO RAGAZZI FACCIO GEL DI POLI-ACRILEMMIDE DA PARECCHIO TEMPO, e rispetto ai gel di agarosio ho parecchie difficoltà nel cercare la migliore risoluzione: esattamente le bande ke ottengo sono sempre sfocate e mai belle chiare e nette come quelle ottenute x i gel d agarosio. Sono molto "imprevedibili" come Gel e soprattutto ho provato a fare di tutto:aumento la concentrazione di aps e temed, lascio polimerizzare x + tempo, faccio fare una precorsa + lunga, metto la soluzione in ghiaccio, cerco di farli + sottili possibili stringendo d+ le lastre,non applico correnti con amperaio troppo elevati .....insomma i risultati (intento la nitidezza delle bande) sono sempre variabili! dei iorni sono PERFETTI ed altri misteriosamente no!!!
QLC1 M POTREBBE DARE DEI CONSIGLI X COME MIGLIORARE LA RISOLUZIONE???
GRAZIE MILLE
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 14:23:10
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ma stai parlando delle bande sulla lastra? o semplicemnte di proteine che vedi su gel con qualche colorante?
se ti riferisci alle bande sulla lastra, a me è capitato che la stessa membrana blottata con 2 anticorpi diversi mi dava in un caso bande nette e nitide e ,nell'altro, bande sfuocate e un generale sporco di fondo. cambiando anticorpo il problema è rientrato.
se invece il tuo è un problema di bande su gel, prova a cambiare acrilammide, oppure prima di versare il temed e l'aps filtra la soluzione e degassala per una quindicina di minuti.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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BIOmartina
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 15:21:26
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allora stavo parlando di "SEMPLICE" DNA caricato su gel di acrilam, quindi niente proteine o anticorpi! Per motivi di tempo non Ho descritto tutta la metodica applicata....cmq le lastre, i pettini e le beute PRIMA DEL LORO UTILIZZO le lava tutte precedentemente con H2O distillata e alcool al95% (proprio x eliminare eventuali residui di acrilam), la soluzione la degasso anke troppo (un'ora a volte) e l'acrilam è nuova!!!
Per quanto riguarda invece la filtrazione non penso sia quella una soluzione...boh...ormai nn ho + idee |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 15:27:20
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ah ok, capito. potrebbe essere un problema legato al campione? ad esempio un campione poco puro? sono solo ipotesi, dal momento che non lavoro con il DNA quindi queste sono solo congetture. aspettiamo che qualcuno + esperto in questo settore ti dia qualche risposta.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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BIOmartina
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 15:39:07
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 .....grazie....non so se può essere una questione di purezza di DNA: io carico su gel circa 25microL di prodotto di amplificazione di DNA genomico+4microL di colorante(precedent aggiunto)... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2007 : 17:00:09
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Mah sinceramente non ho un consiglio, anche a me non vengono mai molto bene i gel di poliarcrilamide per DNA, le bande non sono mai belle come quelle dell'agarosio.
Cerco solo di far andare ad un voltaggio basso per molto tempo, ma mi sembra tu lo faccia già!
Magari puoi provare a mettere in ghiaccio la vaschetta per elettroforesi (o con attorno dei siberini) per tenere il tampone più freddo.
Altro non saprei!
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rosablurg
Nuovo Arrivato
Prov.: Cagliari
Città: Selargius
6 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 11:06:49
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| A me i gelini di poliacrilammide verticali venivano male perchè i supporti erano diffettosi. Però i gel verticali più grandi venivano bene, l'unico accorgimento era il pettine che nelle ultime celle faceva pasticci e mi confluivano. Io passo due volte acqua e alcool,con le veline.Ho ipotesi varie: hai provato a vedere se ci sono inquinamenti nei reagenti, magari non polimerizza abbastanza,c'è diffusione laterale? Poi è termostatato? |
Neuroscienze, genetica molecolare, biochimica metabolica della vita.Nemmeno la microbiologia si serve più tanto del microscopio. Eppure, per tutti, noi biologi, siamo quelli rimasti ancora incollati al vetrino. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 19:59:41
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Bhè per capire bene il problema si dovrebbe vedere che migrazione fa il tuo DNA sull'acrilamide
Nella mia esperienza le bande sono molto più nette rispetto all'agarosio.
Le possibili questioni, a parer mio sono le seguenti...
1) Diverso buffer in cui li fai correre, ovvero il DNA genomico spesso è sporco di tante cose e quindi il prodotto di PCR potrebbe avere una diversa purificazione da sali, proteine membrane e quant'altro che cambiano o danneggiano la migrazione
2) carichi i campioni diluiti nell'acqua invece del buffer che usi per la migrazione... con pezzi di DNA molto piccoli, fino addirittura a 700 bp è facile che le bande si denaturino se le purifichi da sali e li eluisci nella sola acqua... a questo punto le bande si denaturano e vedi delle sfumature, a volte la banda di divide in due.
3) quando mi è capitato di fare la migrazione mettevo una piastra di metallo dietro il gel durante la corsa per migliorare la migrazione (non ho idea del meccanismo esatto per cui dovrebbe migliorare la corsa) non mi è mai capitato di farlo senza e non ho idea degli effetti.
4) buffers riciclati che potrebbero peggiorare la corsa (?!?)
5) io provavo con l'amperaggio costante invece del voltaggio costante (anche questo non mi è molto chiaro in termini di vantaggi/svantaggi)
6) possibile che l'acrilamide sia scaduto o mal conservato?
7) non modificare le quantità di APS o Temed, casomai agita bene senza fare bolle prima di aggiungere uno e poi l'altro.
8) prova almeno per una volta a farti dare delle soluzioni nuove da un altro laboratorio così per vedere se è qualche soluzione tua che non va bene.
di più non saprei, le mie idee sono finite qui.
in bocca al lupo, spero che tu risolva, (...ed in tal caso facci sapere cos'era  )
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BIOmartina
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 16:06:47
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CIAO RAgAZZI, INNANZITUTTO gRAZIE X LE RISPOSTE ALLA MIA DOMANDA....ancora adesso nn so cosa possa essere la causa di profili poco kiari di prodotti di PCR SU GEL DI ACRILAM!
Sicuramente il DNA ke carico su acrilam non lo diluisco in acqua (xkè già così non vedo molto su gel) e come amperaggio penso ke sia costante e basso!
Magari seguirò uno dei vostri consiglii e cioè: cambiare di volta in volta il tampone d corsa(anke se nn penso sia quello)! Sicuram la risoluz dei gel di agarosio è diversa da quelli in poliacr: sarà anke xkè in agarosio uso il TAE (come buffer d corsa) e in acrilam, invece, il TBE! non so....cmq v farò saxe i risultati |
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valefarfa
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Teramo
24 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 23:39:44
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idea forse bizzarra, ma dal momento ke nessuno di noi è riuscito a darti consigli risolutivi in assoluto... beh aggiungo il mio...
prova ad effettuare la corsa in camera fredda e vedi ke succede... |
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Apirlo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2008 : 17:32:44
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Citazione:
Messaggio inserito da BIOmartina
CIAO RAGAZZI FACCIO GEL DI POLI-ACRILEMMIDE DA PARECCHIO TEMPO, e rispetto ai gel di agarosio ho parecchie difficoltà nel cercare la migliore risoluzione: esattamente le bande ke ottengo sono sempre sfocate e mai belle chiare e nette come quelle ottenute x i gel d agarosio. Sono molto "imprevedibili" come Gel e soprattutto ho provato a fare di tutto:aumento la concentrazione di aps e temed, lascio polimerizzare x + tempo, faccio fare una precorsa + lunga, metto la soluzione in ghiaccio, cerco di farli + sottili possibili stringendo d+ le lastre,non applico correnti con amperaio troppo elevati .....insomma i risultati (intento la nitidezza delle bande) sono sempre variabili! dei iorni sono PERFETTI ed altri misteriosamente no!!!
QLC1 M POTREBBE DARE DEI CONSIGLI X COME MIGLIORARE LA RISOLUZIONE???
GRAZIE MILLE
Ciao
Ti consiglio vivamente di utilizzare i gel della Elchrom Scientific che con un nuovo polimero di 3a generazione offre altissima risoluzione sino a poter differenziare 1 base alla volta: www.elchrom.com.
Inoltre le tue bande sfocate hanno una spiegazione dovuto al buffer usato. Fatti mandare un catalogo Elchrom e vedrai nelle prime pagine la spiegazione al tuo problema.
Ciao Andrea. |
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CIA
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Rivadolmo
233 Messaggi |
Inserito il - 26 dicembre 2008 : 17:06:49
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Citazione:
Messaggio inserito da Apirlo
le tue bande sfocate hanno una spiegazione dovuto al buffer usato.
Non avrei mai detto che il baffer potesse dare problemi del genere...
Grazie ;) |
CIA
Se è verde o si muove, è biologia. Se puzza, è chimica. Se non funziona, è fisica.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2010 : 18:48:01
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| Ciao a tutti io ho un problema con lo standard corre sempre e comunque male su gel di poliacrilammide, ho provato a metterne poco tanto, diluito ma niente. Possibili motivi? |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2010 : 13:49:05
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Mi potete consigliare uno standard per un'elettroforesi verticale su gel di poliacrilamide che corra bene?
grazie |
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Imprevedibilità gel acrilammide
Didattica
