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cate85
Nuovo Arrivato
Città: pavia
3 Messaggi |
 Inserito il - 27 novembre 2007 : 17:59:34
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Ciao ragazzi volevo chiedervi un parere...qualcuno riuscirebbe a spiegarmi perchè se faccio correre dei prodotti di pcr su un gel d'agarosio preparato con etidio bromuro(alla concentrazione finale di 0.5 #956;g/ml) ottengo 3 bande, mentre se i medesimi li faccio correre in un gel che non è stato preparato con l'etidio bromuro ottengo 2 bande?
I due gel sono stati preparati nello stesso modo(eccetto che per l'intercalante)e alla fine della corsa sono stati entrambi immersi in una soluzione di bromuro di etidio 5 #956;g/ml per circa 30 minuti.
Secondo voi la banda che ottengo nel gel preparato con etidio bromuro a cosa è dovuta?come si spiega?
Aiutatemi!!!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 19:36:46
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ma quante bande dovrebbero uscire?
e quale banda manca?
a me è capitato per bande molto piccole, tipo 100-200 bp, perché il bromuro tende a migrare in alto e la banda più piccola è la meno intensa e poi quella che si trova dove c'è meno etidio. Colorando il gel dopo la banda piccola si vede perché l'etidio è più omogeneo nel gel.
Nel tuo caso non vedo una spiegazione semplice, anzi un po' strano perché è l'inverso.
Ipotizzo il seguente pensiero, poi vedi tu se questo è possibile
Magari la banda che manca è meno intensa, non colori bene il gel con l'etidio (magari la >2%) e quindi la banda che già si vedeva poco e male dopo non si vede più.
Altra ipotesi altrettanto lunatica potrebbe essere la seguente
La banda è dovuta ai primers che fanno delle strutture secondarie che sono stabilizzate dalla presenza di etidio, e quando l'etidio non c'è durante la migrazione si denatura.
Questo sarebbe possibile al massimo intorno a 100 bp o meno. (mi vergogno di tale ipotesi assurda  )
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
 Inserito il - 27 novembre 2007 : 23:11:38
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misteri....  |
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cate85
Nuovo Arrivato
Città: pavia
3 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 23:18:21
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Le bande che ci aspettavamo di ottenere in laboratorio erano due una di 651pb e l'altra di 630pb...corrispondenti a due isoforme(dovute a splicing) della proteina per cui il cDNA codifica.
Solo nel gel preparato con etidio bromuro era presente una terza banda corrispondente a circa 600pb.
Abbiamo supposto fosse dovuta a amplificato dovuto ad aspecificità dei primer;
eteroduplex;
isoforma originata da splicing alternativo.
Quindi abbiamo rifatto gli esperimenti utilizzando altri primer ma i risultati sono stati gli stessi.
Poi abbiamo fatto un elettroforesi denaturante e c'erano sempre 3 bande.
Per fare quella denaturante il gel non poteva essere preparato con etidio bromuro e per controllo della pcr abbiamo fatto correre i prodotti di pcr su un altro gel preparato in assenza di etidio bromuro...e così abbiamo capito che compariva solo nei gel preparati con
questo intercalante.
Ora qualcuno saprebbe spiegarmi il perchè??
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2007 : 23:51:31
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Ma aspetta, prima dici che anche in quella denaturante ci sono 3 bande e poi invece che per fare quella denaturante non metti l'EtBr nel gel e quindi ne hai solo 2... mi sembra una contraddizione... o sono io che a mezzanotte sono un po' cotta e non capisco!
hm... |
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cate85
Nuovo Arrivato
Città: pavia
3 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2007 : 00:21:50
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cerco di spiegarmi meglio:
in quella denaturante nel gel non c'è bromuro di etidio(NON SI PUò PREPARARE COL BROMURO)ma dopo la corsa il gel viene immerso nella soluzione con il bromuro e si vedono tre bande;
Poi per controllare che la pcr sia venuta bene...faccio correre su un gel normale(cioè non denaturante)e questo gel è preparato senza etidio bromuro
e come quello denaturante viene immerso dopo nella soluzione con il bromuro e si vedono 2 bande....è più chiaro adesso? |
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2007 : 16:38:57
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Quindi: denaturante --> immersione --> 3 bande
non denat. --> immersione --> 2 bande
mii pare che c'entri la denaturazione a questo punto... o no? |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2007 : 20:42:34
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se ho capito bene i risultati sono 3
1) PCR su gel classico con etidio bromuro -> 3 bande
2) PCR su gel denaturante senza etidio con staining successivo -> 2 bande
3) controllo del punto 2, PCR su gel non denaturante senza etidio con staining successivo -> 2 bande
dal risultato del punto 3 e del punto 1 si deduce che l'effetto è dovuto all'etidio
se ho capito bene
la mia 1a domanda è quanto sono intense queste bande? Tutte uguali o quella da 600 è debole?
la mia 2a domanda, anzi dubbio, è come riesci a discriminare bande di 600, 630 e 651 bp (ovvero differenze del 5%)? Con le mie limitate capacità riesco a malapena a discriminare 580 da 640 bp (ovvero differenze del 10%).
Dai protocolli e consigli del Sambrook ricordo che con l'agarosio non si potevano riconoscere differenze al di sotto del 10% in bp, e nella mia esperienza quotidiana mi trovo, poiché c'è sempre un po' di variabilità durante la migrazione.
Sarei curioso di vedere la foto del tuo gel con staining successivo e preparato già con etidio.
p.s.: non ho mai sentito parlare del gel denaturante con staining successivo, so solo di gel fatti con la formaldeide che dà fluorescenza quando è in contatto con l'editio e che quindi si preferisce non aggiungerlo al gel ma nei campioni. Se prepari il gel con l'etidio o ne fai lo staining dopo non vedo la differenza. |
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etidio bromuro e prodotti di pcr
Didattica
