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doraemon
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
 Inserito il - 28 novembre 2007 : 20:14:24
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 help..sapreste dirmi dove trovare (oppure datemela voi ) una esauriente spiegazione sul dosaggio enzimatico? non ci sto capendo molto.. ho solo informazioni sconnesse..
ci sono sul fatto che ci si basa sulla quantità di substrato consumato/prodotto formato..ma mi perdo sulle questioni pratiche..la legge di lambert e beer..i mg dell'enzima..insomma come si fa effettivamente un dosaggio enzimatico?
grazie grazie!
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
 Inserito il - 28 novembre 2007 : 21:27:25
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è un argomento troppo complesso da poter spiegare brevemente.
praticamente dosare un enzima significa ricavare informazioni sulla reazione che esso catalizza. ci sono dosaggi in cinetica, cioè si studia appunto la cinetica della reazione nel tempo, o dosaggi semplici dove vai a misurare quantità di prodotto formato o substrato consumato. ogni dosaggio è diverso dall'altro e presuppone la conoscenza della reazione che catalizza. quello che si fa è preparare una miscela che in genere contiene un buffer (per mettere l'enzima nelle condizioni ottimali di pH, forza ionica, ecc), il substrato/i, vari cofattori ed elementi indispensabili alla reazione.
ammettiamo che vuoi saggiare un enzima che produce un prodotto X. e sai che X è un composto che assorbe la luce ad una determinata lunghezza d'onda. quello che fai è allestire la reazione con tutti i componenti, incubarla per un tot di tempo, e andare a leggere il campione alla lunghezza d'onda di X. poi (o prima) devi costruirti una retta di taratura: fai soluzioni a concentrazioni crescenti di X e le leggi a quella lunghezza d'onda. avrai una retta di assorbanza in funzione della concentrazione. quindi dalla lettura del dosaggio che ottieni risali alla concentrazione di X.
tale concentrazione poi lo rapporti alla quantità di enzima che hai usato e al tempo di reazione (cioè di incubazione) per trovarti l'ATTIVITA' enzimatica, che è definita in maniera diversa per ogni enzima, che di solito è la quantità (ad esempio in mg) di enzima che produce una certa quantità di prodotto (ad esempio in uM) in un tempo (es. minuto).
non è facile spiegarlo così.
altri dubbi? |
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doraemon
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2007 : 00:08:40
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grazie! mi hai chiarito un passaggio. però avrei bisogno di un esempio pratico per capire meglio..in particolare ho qualche problemino con le unità di misura.
supponiamo di voler dosare la LDH nel siero.
metto 100 microlitri di siero, 100 microlitri di NADH, 800 microL di tampone.
misuro l'assorbanza al tempo zero: è 1,240. a due min è pari a zero. ad un min è 0,622. mi ricavo la concentrazione di NADH: 0.622/coeff.di estinz molare del NADH. ma qual'è il valore di questo coeff? sugli appunti che mi hanno dato c'è scritto 6.220 M alla meno 1 per cm alla meno 1..qui da qualche parte ho letto 6,220 M alla meno uno per cm alla meno 1...
vorrei capire:
1.come trovo la concentrazione di NADH (0.622 fratto cosa? devo cambiare l'unità di misura del coeff. di estinz molare vero?)
2.come arrivo a determinare le unità enzimatiche nella cuvetta (1 mL)?
un'ultima domanda.. cos'è una micromole??
ancora grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2007 : 10:42:09
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la legge di Lambert-Beer dice che A= C l epsilon, dove:
A = assorbanza
C = concentrazione
l = cammino ottico (che di solito per gli spettrofotometri è 1 cm)
epsilon = coefficiente di estinz. molare
il coefficiente di estinzione molare è il rapporto tra A/C. in pratica è lo slope, cioè la costante che rappresenta la pendenza della retta di taratura.
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dosaggio enzimatico
Didattica
