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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2007 : 12:46:23
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Buongiorno a tutti
è la prima volta che scrivo ma vi seguo da molto tempo, i vostri suggerimenti sono molto preziosi tanto è vero che me li salvo in word in una cartella nominata molecularlab.Frequento da poco un lab di biologia molecolare applicata alle piante,ultimamente ho cominciato a fare PCR con marcatori tipo ssr,issr,rapd.Ho dei dubbi di carattere generale,aiutatemi se potete:
1)come faccio a calcolare i volumi e le concentrazioni dei componenti della pcr (acqua,primer,mgcl2,Dna,buffer,dntp,taq)considerando un volume finale di 25 microlitri?Negli articoli usano solo concentrazioni (a volte diverse).
2)Se ho due primers da usare insieme,come devo calcolare il loro volume complessivo,cioè devo usarne vol.uguali che sommati danno il volume da usare?
Grazie
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2007 : 19:19:50
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Help...scusate ma rileggendo il mio post noto che non è particolarmente chiaro.Quindi cercherò di spiegarmi meglio:
1)che proporzione esiste tra i volumi delle sostanze che miscelerò per fare la pcr (acqua,dntp etc)considerando un vol finale di 25 microlitri.Quanta taq va messa e così via per le altre sostanze perchè ci sia un giusto rapporto fra di loro?
2)se ho due primers alla stessa conc.da usare insieme nella stessa pcr,dovrò usarne volumi uguali o differenti?
3)le bande sbiadite,gli smiles come si correggono?bisogna intervenire sulla temp.di annealing?
Spero di essere stato un pò più chiaro.grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2007 : 08:56:09
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Grazie 1000, non avevo visto quel link.Ovviamente i volumi potranno essere modificati anche se di poco.Se io ho un solo primer,il volume devo ridurlo ?Per quanto riguarda gli smiles,le bande sbiadite,come devo intervenire in linea di massima?
Grazie |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2007 : 12:21:30
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Caro ser
oltre al prezioso protocollo che chick ti ha fatto notare,
posso dirti che piu in generale per calcolarti la quantità di un reagente da aggiungere in una miscela puoi seguire questa piccola regoletta:
concentrazione iniziale del reagente/concentreazione finale= fattore di diluizione
Volume finale della soluzione che vuoi preparare/fattore di diluizione.
Esempio: MgCl2 50mM (CONCENTRAZ INIZIALE)/1,5mM (CONCENTRAZIONE FINALE= 3,3333333 (FATTORE DI DILUIZIONE)
50 uL (VOLUME FINALE DELLA SOLUZIONE CHE VUOI PREPARARE)/3,33333333333= 1,5 uL
quindi in questo caso per avere una concentrazione finale di MgCl2 di 1,5 mM in una miscela di 50 ul devi aggiungere 1,5 ul di MgCL2.
Per quanto riguarda le bande sbiadite puoi provare a rifare la PCR dimunendo la temperatura di annealing ed aumentando la concentrazione di MgCl2. tuttavia in questo caso potrai avere problemi di aspecificità. che cosa intendi per smiles?
I primers sicuramente vanno utilizzati nella stessa concentrazione per cui se la concentrazione della soluzione stock iniziale è uguale per i due primers devi utilizzare lo stesso volume. ad esempio in genere io ho sia l'oligo forward che reverse concentrati 10 uM ed utilizzo 3 ul ciascuno.
Spero di essere stato chiaro, anzi se qualcosa non lo è non esitare a chiedere.
buon lavoro |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2007 : 12:43:30
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Ancora grazie 1000,molto chiaro ma ancora una domanda:se devo preparare una pcr di 10 campioni da 25 microlitri l'uno,devo considerare come volume finale 25X10 cioè 250 microlitri + quota aggiuntiva,per calcolare i volumi alla conc.voluta dei singoli componenti secondo la formula da te data?Spero che la mia domanda sia posta bene!Per gli smiles intendo la banda un pò curvata con concavità verso l'alto,a volte capita nelle pcr non fatte bene,così definite in gergo.Vi risulta?grazie
inoltre chi di voi è nel campo vegetale? |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2007 : 23:59:24
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Il volume finale dellA soluzione che devi utilizzare in questa formuletta, in questo caso, è semplicemente 25 ul (NON devi fare la somma dei 10 campioni ed aggiungere la quota aggiuntiva).
Gli Smiles in genere dipendono dal voltaggio che utilizzi durante la corsa elettroforetica.....prova ad abbassare il voltaggio. In genere io quando corro su gel di acrilammide i campioni caricati nei due pozzetti piu estremi (destra e sinistra) formano sempre delle bande con smiles....credo che questo dipende dal fatto che il voltaggio non è costante.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 00:30:13
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Sì, in generale gli smiles ai bordi del gel sono dovuti al fatto che gli elettrodi nella vaschetta non creano un campo elettrico perfettamente costante ai bordi.
Oltre a diminuire il voltaggio una cosa che può influire è il buffer di corsa del gel: se lo riusi troppe volte è più facile avere bande sbiadite o distorte. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2007 : 08:48:40
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sempre molto esaurienti,grazie.
Ai prossimi dubbi |
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