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Cangrande
Utente Junior
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 Inserito il - 10 dicembre 2007 : 11:58:41
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Secondo la vostra esperienza, quante bp devo tener conto, al 5' del codone di start, per poter analizzare "discretamente" una regione promotrice.
Ho sentito valori tra le 1500 e le 2000 bp. Voi che mi dite?
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Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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darkene
Utente Junior
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 Inserito il - 10 dicembre 2007 : 21:05:30
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| io ho fatto in tesi un lavoro del genere. dovevo fare dei saggi luciferasi e ho clonato pezzi di varia lunghezza, cioè 0/-1000,0/-5000, 0/-10000. alla fine i siti di legame per i fattori di mio interesse erano nel segmento da mille. però io se fossi in te farei diverse prove. |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
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Inserito il - 13 dicembre 2007 : 17:38:17
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| Ok grazie. Penso che la lunghezza dipendi anche dalla spesie analizzata. Presumo che Arabidopsis e Drosophila abbiano seq più limitate rispetto a mais ed uomo. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 18 dicembre 2007 : 20:21:38
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nel mio caso la sequenza si trovava a 30.000 basi di distanza dalla regione codificante ed era composta da 300 bp nella regione minima, fortuna che era già stata pubblicata in precedenza per cui mi sono basato su delle regioni promotrici "putative".
Insomma dipende dalla fortuna che hai, questo gene potrebbe avere un piccolo promotore vicinissimo all'ATG (2-300 basi di distanza) oppure un po' di sfortuna e trovare il promotore a diverse migliaia di basi dall'ATG. Non direi che la Drosophila debba avere dei promotori più vicini o più piccoli rispetto all'uomo, ciò non è assolutamente detto.
Le principali differenze risiedono nella minore complessità del genoma, ovvero meno geni e meno splicings alternativi, ma resta comunque la complessità regolatoria dei fattori trascrizionali e dei promotori.
in bocca al lupo
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
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Inserito il - 23 dicembre 2007 : 11:55:56
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| Ok grazie.Ma tu hai poi fatto uno studio del promotore con 30.000bp. Non deve esser stato semplice... |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 24 dicembre 2007 : 15:54:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Cangrande
Ok grazie.Ma tu hai poi fatto uno studio del promotore con 30.000bp. Non deve esser stato semplice...
No, assolutamente, la regione promotrice minima è di poche centinaia di basi, è la distanza dall'ATG che è di 30.000. Per mia fortuna c'era già stato uno studio preliminare che individuava in questa regione il promotore. Per cui ho analizzato sequenze di 1200 basi al massimo, messo in pGL3 (luciferasi) e poi sottoposto a tagli e mutazioni. Nel mio caso era relativamente semplice. Provare a clonare 30.000 basi è da suicidio... meglio comprarsi un BAC di quella zona, poichè non riusciresti a mutarlo, a trasfettare e difficile sarà anche a crescerlo in batteri. |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
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Inserito il - 08 gennaio 2008 : 16:54:59
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Che tipo di lavoro eraq quello su cui ti sei basato? Vorrei capire alcune metodologie per capire la lunghezza del frammento da prendere. Come mai tu hai studiato fino a 1200bp?
Magari è una domanda stupida ma ho visto che non c'è molta chiarezza qqunado si parla di promotori e regioni regolatrici. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Neuroscience
Utente
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Inserito il - 08 gennaio 2008 : 19:20:17
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Caro Cangrande,
Premetto che non sono un esperto di promotori, ma nella mia esperienza mi è capitato di doverne studiare uno. Per quello che so, lo studio di un promotore è un grosso punto interrogativo, poiché ne esistono di semplicisssimi, almeno in apparenza, e di complicatissimi.
L'esempio più semplice è quello dell'aldolasi C neuronale, dove i ricercatori hanno semplicemente fatto una PCR a monte della sequenza codificante (circa 500 bp mi pare) e poi hanno fatto un saggio con la luciferasi dimostrando che tale sequenza era sufficiente per l'attività promotrice. Hanno poi seguito la strada dei tagli e delle mutagenesi dimostrando hanno visto che una breve sequenza nucleotidica è responsabile sia dell'espressione che della specificità tissutale.
L'esempio più complicato invece è quello che è capitato a me, dove la regione promotrice era molto distante dall'ATG, per cui i ricercatori hanno fatto una 5'RACE per trovare la sequenza dell'mRNA a monte dell'ATG, l'hanno ritrovata sul genoma e poi hanno fatto una serie infinita di tentativi di clonaggi e di calcoli computerizzati per trovare una regione promotrice.
La sfortuna/fortuna volle che l'inizio della trascrizione avviene all'interno della regione promotrice, ed a seconda del tessuto in cui si va a fare l'analisi funziona una regione promotrice diversa. Per essere più chiari, la parte codificante è sempre a valle e di conseguenza è sempre uguale, mentre nella parte 5'UTR c'è una variabilità dovuta alla regione promotrice che ha dato inizio alla trascrizione.
Per complicare la cosa esiste anche un pre-splicing, che avviene prima dello splicing vero, che taglia alcune regioni del 5'UTR dell'RNA dove ci sono questi promotori, generando un primo esone non codificante che è diverso da tessuto a tessuto.
Conosco il gruppo che ha fatto questo lavoro e sono 3 dei maggiori esperti mondiali del gene di interesse, oltre ad essere molto intelligenti ed esperti di genetica. In definitiva hanno sofferto 3 anni e non lo rifarebbero mai più.
Io invece ho preso semplicemente le 1.200 basi che conteneva la regione che loro avevano identificato come la regione minima per far esprimere l'RNA nel cervello ed ho verificato se uno di questi siti putativi era vero oppure no. Il sito da verificare lo sapevo già e dista circa 800 bp dalla regione minima di 320 bp, quindi 870+320 = 1190 bp, presi qualche base in più per avere anche l'intorno del mio sito putativo ed ecco come uscito 1.270 bp. Tutto qui
Secondo il mio schema mentale metterei in ordine i seguenti punti
1) individuare la 5'UTR dell'mRNA e di conseguenza dove inizia la trascrizione sul genoma
2) usare un programma per individuare regioni contenenti siti putativi per fattori trascrizionali, tipo Sp1, AP1, NFkB, GATA etc etc, (ovviamente compatibili con le regioni dove il gene è espresso, es nel promotore dell'aldolasi neuronale, non cerco SP1 che è ubiquitario) La ricerca dovrebbe partire immediatamente a monte dell'inizio della trascrizione e mano a mano sempre più lontano.
I fattori trascrizionali non lavorano mai da soli.
3) clonare o comprare BAC contenenti la regione che contiene l'inizio della trascrizione, clonarlo in un vettore che ha il cDNA della luciferasi e verificare se c'è una debole attività trascrizionale.
4) accorciare un po' la sequenza per trovare la regione minima che funziona ancora.
Premesso che tu abbia una buona guida e tanta volontà, questo già basta per ottenere una pubblicazione discreta
Di qui le strade si dividono su cosa vuoi ottenere, però per fare altro avresti bisogno di un gruppo di ricerca alle spalle ti supporti parecchio, perché gli esperimenti sono lunghi, difficili da interpretare e soprattutto solo l'1% degli esperimenti ti darà risultati entusiasmanti. Arrivare al punto 4 è sarà come trovare un'oasi nel deserto dopo aver vagato 2-3 anni. Se poi ci sarà un pizzico di fortuna ad aiutarti ben venga.
In bocca al lupo
P.S.: la differenza tra promotore e regione regolatrice è netta. Il promotore è quella regione che ti consente la trascrizione. A questa regione possono partecipare delle sequenze regolatrici che si possono trovare all'interno del promotore, dopo oppure prima. Il ruolo di queste sequenze è quello di modificare l'espressione genica in funzioni di particolari esigenze, es tessuto specificità, maggiore espressione in alcune aree, oppure aumento/diminuzione della trascrizione in funzione di un particolare stimolo.
Ad esempio esistono regioni regolatrici a monte dei geni neuronali che non permettono l'espressione di questi geni in cellule non neuronali (REST). Se togli queste sequenze il promotore funziona in maniera uguale in tutti i tipi cellulari.
la sequenza AP-1 consente una maggiore espressione in seguito all'attivazione delle MAPKiasi, quindi dell'interazione dei fattori di crescita con i recettori (tantissimi geni).
In somma le regioni regolatrici interferiscono con l'attività promotrice, ma da sole non servono a niente. |
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blue_sky
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 09 gennaio 2008 : 15:44:01
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dovresti distinguere tra promotori prossimali e distali e poi con gli enhancer.
un promotore prossimale lo puoi trovare in alcuni casi anche dopo la UTR-3' o proprio dentro il gene stesso - in qualche suo introne.
di solito ti cerchi una tata ed una CAAT BOX. sono il 30% quelli che la dovrebbero avere. se non hanno una CAAT e/o una TATA hanno dei siti alternativi. per geni espressi in brain hai dei siti per i TF della famiglia SP. o anche AP. hanno una sequenza come ggggcgggg o qualche cosa del genere.
puoi provare pure con le sequenze GATA.
comunque, il promotore prossimale é quasi sempre tra 3-500 bp a monte dell'UTR nel 5'. Dentro l'UTR stessa che io sappia mai. Trovai un solo articolo, anni fa, ma non ricordo grossi seguiti.
a parte i saggi di luciferasi, che possono darti un idea piuttosto grossolana, puoi farti dei saggi EMSA per capire che tipo di TF si legano in quelle regioni, mutarle e perderti il segnale.
sono tutte prove in vitro peró.
per capire un intero promotore, forse, non basta una vita ;)
sull'uso del BAC...mah...a meno che non vuoi farti un mouse transgenico e fluorescente, non vedo applicazioni pratiche per studiare un promotore.
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 00:52:11
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Promotori dentro l'UTR purtroppo ce ne sono, non so quanti geni, ma ci sono, uno di questi purtroppo è capitato a me, sebbene non siano presenti tutte le regioni promotrici dentro il 5'UTR.
I saggi di EMSA per questi scopi è del tutto fuori questione nei primi stadi dello studio, serve essenzialmente per verificare se un oligo di poche basi potrebbe essere legato un fattore trascrizionale, in alcune condizioni.
Se trovi una sequenza che è legata da un fattore trascrizionale non significa che lì ci sia un promotore, anzi di sequenze che possono essere legate da fattori trascrizionali ce ne sono a migliaia nel genoma in modo del tutto (?) inutile, apparentemente.
In genere si fa al contrario... prima si fa una cosa grossolana con la luciferasi che è di fatto l'esperimento d'elezione per individuare la regione minima promotrice. L'emsa viene molto dopo, per valutare l'eventuale compatibilità di un certo fattore trascrizionale con una sequenza consenso. In realtà l'esperimento migliore è fare la mutagenesi direttamente nel contesto del promotore per valutare se è effettivamente responsabile di una funzione, poi con l'EMSA valutare se quel fattore trascrizionale si lega a quella sequenza, o in alternativa si fa un footprinting, ma queste cose sono da lavori successivi come quello che ho eseguito io. Alcuni hanno identificato per luciferasi la regione minima, individuando sequenze putative, ed io ho colto la palla al balzo ed ho verificato se una di queste sequenze putative è legata o no dal fattore X e se effettivamente questo comporta una variazione della trascrizione durante l'ischemia cerebrale.
Giusto per informazione il BAC è l'unica soluzione per prendere una grande regione di genoma senza rompersi la testa a fare Long PCR, seguite da sequenziamenti, clonaggi improbabili, e poi addirittura manipolarlo in modo rocambolesco per ripristinare eventuali errori di PCR senza inserire altri errori e soprattutto sperando di trovare strani enzimi di restrizione ai lati della mutazione per inserire la sequenza corretta. Per non parlare dei costi dei primers e dei sequenziamenti per qualcosa del tipo 10.000-20.000 basi di regione genomica che puoi comprare ad un prezzo ed un tempo ragionevole. Certo se impieghi un 6-12 mesi per clonare solo il promotore non puoi aspettarti certo di finire lo studio entro i 3 anni di dottorato.
L'uso del BAC certamente non è reclutato alla sola produzione di topi transgenici.
Anzi, come in uno dei miei progetti attuali possono servire per lo studio di polimorfismi intronici nella modulazione dell'espressione di un gene o nello studio epigenetico.
La cosa con cui concordo è che c'è bisogno di uno studio molto intenso e lungo per capire un promotore.
Ogni lavoro può raccontare un dettaglio, ma di certo non è mai conclusivo, anche il promotore più studiato nasconde sempre dietro l'angolo qualcosa di nuovo ed inaspettato.
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blue_sky
Nuovo Arrivato
Città: berlin
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Inserito il - 10 gennaio 2008 : 14:44:31
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i saggi EMSA seguirebbero quelli di luciferasi e come giá detto sopra, sarebbero sempre esperimenti in vitro, quindi con molti punti interrogativi. per un lavoro un po' piú completo sarebbe anche da ricercare il punto d'inizio della trascrizione.
per quanto riguarda i promotori nella UTR...mah...immagino che a monte debba avere altro la famosa 5'_UTR. altrimenti chi la trascrive???
é ovvio poi, che un promotore prossimale abbia almeno un TF attivante. Cosí come é ovvio che se cloni 300 BP contenente la consensus con il TF, al 90% la luciferasi schizzerá in alto.
Ma non é una prova per dire "é il promotore del gene che segue".
potrebbe essere un enhancer di qualche cosa d'altro.
sull'uso del BAC resto perplesso. avrai sicuramente tutta la regione promotrice del gene (diciamo il 95% di probabilitá di averla tutta).
ma poi come lo maneggi? PCR e luciferasi, apportando delle delezioni o delle modificazioni a monte e/o a valle del gene???
non mi sembra un lavoro migliore che amplificare genomico e clonarlo in vettori con luciferasi!!!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2008 : 18:13:40
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Caro blue_sky,
Sono d'accordo con il 90% di ciò che scrivi, e ti confesso che io non sono un esperto di trascrizione, mi intendo più di genetica. Tuttavia capire dove c'è l'inizio della trascrizione è l'esperimento più banale, nella maggioranza dei casi basta fare il 5'RACE dell'mRNA e trovare la 5'UTR, poi allinei con il genoma ed il punto di inizio della trascrizione è determinato.
Per la vicenda dei promotori nell'UTR hai ragione, in effetti non c'è mai tutto il promotore, o almeno non ne conosco casi, però può essere presente una parte rilevante, ovvero senza la quale il promotore non fuziona. Nel mio caso, il gene ha una regione promotrice costituita da tre regioni che funzionano in tessuti diversi; secondo il promotore che è utilizzato l'inizio della trascrizione avviene in un punto diverso ed è sempre interno al promotore stesso. Non parlo di enancher, ma di veri promotori. Di conseguenza un promotore fa trascrivere solo parte di sè più il resto del gene; il promotore centrale fa trascrivere il gene più il promotore più prossimale; ed il promotore distale fa trascrivere parte di sè, gli altri due promotori ed il resto del gene.
Non credo che sia tanto frequente, ma purtroppo è possibile.
La differenza tra enhancer o "altro" ed un promtore è anch'esso di per sè una cosa relativamente semplice da determinare. L'enhancer ha bisogno di un promotore per la luciferasi per funzionare, quindi in genere lo si clona in un vettore con luciferasi con un promotore tipo il CMV; senza questa sequenza la luciferasi non si vedrebbe.
Il promotore invece ha un'altra storia, basta semplicemente metterla a monte di un cDNA e questo è espresso se c'è una espressione basale del gene. Questo avviene a prescindere che ci sia o no a monte la sequenza promotrice del CMV.
Detto questo, so bene che mi dirai che alcuni, compreso il sottoscritto, utilizzano spesso vettori della luciferasi con già integrato un promotore del CMV per aumentare la capacità di trascrizione del promotore che cloni, ma questo è un altro discorso.
Vero è quello che dici, ovvero che non c'è mai una prova finale che hai preso "il promotore" del gene X, infatti, in genere si parla della regione promotrice minima del gene X che è sicuramente più vicino alla verità.
Per quanto riguarda il BAC, bhé non vorrei fare lezione di biologia molecolare, ma basta semplicemente prendere due enzimi di restrizione, tagliare la sequenza che ti interessa e clonarla nel vettore della luciferasi, esperimento banale, che sa fare anche un tesista di media esperienza.
Senza la necessità di sequenziamenti e PCR, cloning intermeti etc.
Praticamente entro 2-3 giorni hai già la tua regione nel vettore della luciferasi e stai già facendo esperimenti.
Ovvio che quando fai le modifiche di mutagenesi hai la stessa difficoltà in entrambe le strade proposte; tuttavia considera ché quando fai PCR molto lunghe sono capita sempre che su 10.000-20.000 basi ci sia 2-3 mutate.
Ora tu mi dirai "tanto fai la mutagenesi e la riporti al WT", ed io ti rispondo "bisogna essere pratici, attraverso il BAC hai il DNA già corretto, tagli la parte che ti interessa e la cloni in un vettore e fai gli esperimenti. Tutto il lavoro dalla progettazione all'operatività è dell'ordine di 2-3 giorni. Se e quando vuoi fare la mutazione, scegli tu il punto migliore e la strada per farlo con una strategia consapevole; mentre nel tuo caso devi risolvere un puzzle che capita a caso; fai una PCR e le mutazioni compariranno a caso. Di certo non puoi mandare a sequenziare 2-3 frammenti di PCR, il tuo laboratorio andrebbe in fallimento per i costi del sequenziamento, prova a fare i conti con quanti sequenziamenti sarebbero necessari per coprire una regione di 10.000-20.000 basi inclusi i costi dei primers e le difficoltà che potrebbero avvenire durante i sequenziamenti. Detto questo preferiresti fare la PCR o prendere direttamente il BAC?"
Per le mutazioni successive all'identificazione del promotore e magari delle sequenze di legame di fattori trascrizionali è ovvio che è lo stesso, il vettore della luciferasi finale sarà infatti identico per entrambe le strade, quindi identico anche la metodica di mutazione.
La differenza sta nei costi e nei tempi tecnici per avere il vettore della luciferasi che comprende la zona che ti interessa.
Spero di essere stato abbastanza chiaro, per il resto il mondo è bello perché ci sono idee diverse e metodologie diverse; se avessimo tutte le stesse idee la ricerca stessa ne soffrirebbe molto e ci sarebbe un mondo peggiore a mio avviso.
Grazie per le riflessioni cmq
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