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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 19 dicembre 2007 : 14:49:05
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ciao a tutti!!! sono nuovo e mi presento con un rebus... che poi è il mio rebus!
ho una sequanza di 2000 bp, di questi, gli ultimi 300 da una parte e dall'altra sono ripetuti e invertiti.
Se cerco di amplificare la banda con PCR, con primers esterni ai 2000 bp, questa da esito negativo, molto probabilmente perchè le 300 bp si annilano tra di loro creando una specie di forcina che fa saltare la polimerasi da un punto all'altro senza amplificare quello che c'è in mezzo.
Secondo voi come si può risolvere il problema?
grazie!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 15:08:46
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Bhé iniziamo con il titolo del topic che è troppo generico, meglio dare un titolo più consono.
La tua interpretazione del "fenomeno" mi pare sia debole in quanto nel genoma ci sono centinaia di sequenze ripetute eppure si riesce a fare qualche PCR senza paricolari accorgimenti.
Considera che quando fai la PCR parti da 94-95°C dove si denatura tutto anche la possibile forcina, nell'annealing gli oligo si possono inserire tranquillamente e la taq può svolgere il proprio lavoro
se fosse vero quello che dici, ciò avverrebbe indipendentemente dalla presenza di sequenze ripetute ed invertite, poiché tu fai la PCR su dna a singolo filamento, c'è sempre un altro filamento complementare che può fare delle strutture strane.
La prima domanda è la seguente:
hai provato diverse temperature di annealing e diverse coppie di oligo prima di gettare la spugna e dare la colpa alla squenza a forcina?
La maggioranza delle volte per cui una PCR non viene è causata dagli oligo disegnati male, ricorda che la Tm che misuri è solo predittiva, quindi ci possono essere delle differenze tra quelle che ottieni mediante un calcolo e la Tm effettiva della coppia di oligo.
Altra domanda è se la tua taq riesce con efficienza ad amplificare 2000 bp, spesso le ditte dicono o non dicono bene qual è l'efficienza della loro taq oltre una certa lunghezze. Hai mai amplificato tratti così lunghi con la tua taq con una buona efficienza?
Altra domanda è se questo DNA è puro, se hai provato a diminuire o aumentare la quantità, per vettori basta <50 ng, per DNA genomico anche oltre i 200 ng se è pulito.
altra possibilità è provare con un po' di DMSO da 0,5% fino al 10% aumentando un po' la taq, oppure usare la formammide. Ci sono Taq in commercio specializzate per zone ricche in GC
In bocca al lupo
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 16:06:06
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magari il titolo del topic è generico ma speravo di attirare la curiosità!
anche se la PCR ha un ciclo di denaturazione a 94 gradi la temperatura di anniling è decisamente più bassa e questo implica la possibilità di formazione di questi loop.
Se una sequanza è ripetuta e invertita, questa è presente su entrambi i filamenti! ne consegue che anche sul DNA a singolo filamento hai lo stesso problema.
La Tm è una cosa che viene calcolata con la composizione del primer (non solo come nucleotidi ma anche come sequenza), oltre a scegliere coppie con Tm vicini, variando la temperatura puoi ottenere solo falsi positivi.
Per quanto riguarda la concentrazione del DNA, si possono fare diverse considerazioni:
- a mio avviso 200 ng/microl sono tanti... una PCR la puoi fare anche su quantità inferiori a 10ng/microl
- il DNA molte volte non è una cosa che compri al supermercato ma che estrai da campioni... se questi sono pochi ti devi adattare!
altri suggerimenti?
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 22:13:56
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ultimo post.
uhmm
rispetto le tue osservazioni anche se le trovo del tutto inappropiate.
Cerco di rispondere punto per punto
1) non nego la possibilità della formazione di un loop, dico che nella mix di PCR ci sono miliardi di sequenze complementari (i singoli filamenti si cui è composto il DNA), quando abbassi la temperatura a 50-60°C per l'annealing troverai di sicuro tantissime regioni che si sono appaiate, ed in maniera più o meno corretta.
Trovo assurdo che tu pensi che alla temperatura di annealing si formi solo un loop senza considerare che tutto il DNA genomico (nel caso di genotipizzazioni ad esempio) a questa temperatura non si trova più a singolo filamento, ma riarrangiato in tutte le possibili combinazioni, anche a doppio filamento. Il loop è solo una goccia di problema in un mare di riarrangiamenti di tutti i tipi che il DNA a singolo filamento può avere. Quale difficoltà potrebbe avere la Taq ad amplificare una regione a doppio filamento che non ritrovi quando fai una PCR su genomico alla temperatura di annealing di 54°C ?
Per convincerti ancora di più ti dico che ai fini di una normale genotipizzazione di routine in laboratorio io faccio amplificare da una tesista che lavora con me un triplo segnale di poliadenilazione di circa 700 bp separate da sequenze loxP e FRT di 2-300 basi, e lo facciamo con una banale Taq eppendorf su DNA genomico estratto dalla coda di topo. Se vai ad analizzare la sequenza di cui sto parlando (FRT-LoxP-tpA-tpA-tpA-LoxP-FRT) è interamente ripetuta ed invertita in ogni sua parte. La PCR è facilissima. Per cui chiudo l'argomento.
2) La temperatura di melting è ottenuta SOLO su dati sperimentali, ti invito a leggere la letteratura a riguardo qualora tu non lo abbia mai fatto.
Rychlik, W. and Rhoads, R.E. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 8543.
PCR Core Systems Technical Bulletin #TB254, Promega Corporation.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Mueller, P.R. et al. (1993) In: Current Protocols in Molecular Biology 15.5, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, New York.
Borer P.N. et al. (1974) J. Mol. Biol. 86, 843.
SantaLucia, J. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 1460.
Allawi, H.T. and SantaLucia, J. Jr. (1997) Biochemistry 36, 10581.
von Ahsen N. et al. (1999) Clin. Chem. 45, 2094.
Nakano S. et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27, 2957.
Le formule che ci sono in giro più o meno complesse, che tengono conto della sequena degli oligo, della quantità di sali, di sequenze, di entalpie, delle concentrazioni dei primers, delle rampe di deltaT sono solo delle simulazioni che si basano in parte su dati empirici (sperimentali). Se leggi bene le note in piccolo non garantiscono mai che le temperature siano rispettate e spesso le formule sono in contraddizione tra loro, ogni tanto sono anche aggiornate, non mi dire che se l'unico al mondo che ha la formula perfetta e non l'hai ancora pubblicata.
Per convincerti ancora di più ti invito a prendere una decina di articoli in cui fanno delle PCR, prenditi le sequenze utilizzate e calcolati le Tm di ogni primer, verifica se è o no quella che gli autori hanno utilizzato per fare le PCR nei materiali e metodi.
Chi ignora queste elementari problematiche quando fa una PCR non merita altri commenti
3) il fatto che tu trovi 200 ng/microlitro tanto mi fa supporre che tu non abbia mai estratto DNA genomico o plasmidico, poiché per entrambi i casi è una concentrazione miserevole. Se intendevi 200 ng totali per fare una PCR ti invito nel mio laboratorio dove faccio delle genotipizzazioni su cellule ES utilizzando 1,2 microgrammi di DNA genomico in 25 microlitri di volume di reazione con Taq Expand Roche per amplificare regioni di 7.800 basi come alternativa allo screening per Southern blot radioattivo.
E' facile calcolare che in queste 7.800 basi ci sono più di qualche centinaio di regioni ripetute che potrebbero fare degli annealing a ZIP più che a forcina, eppure le PCR escono.
Certo che la PCR la puoi fare anche con 10 ng di DNA totali, però se calcoli che su un vettore 10 ng corrispondono a circa 5 ng di templato (calcolo fatto in base alla % di basi che vuoi amplificare rispetto alla totalità del vettore), mentre nel caso del DNA genomico 1 microgrammo di DNA corrispondono a nemmeno 1 picogrammo di templato (il rapporto è basi dell'amplicone diviso per 10^9).
Usare più di 10 ng di DNA, specie se non è integro, sarebbe consigliabile.
Diverso è il caso in cui insieme ad 1 microgrammo di DNA ci sono 10 microgrammi di proteine, cloroformio ed altre schifezze che disturbano la PCR, in questo caso si consiglia di mettere meno DNA o di diluirlo per rendere la PCR più pulita e più efficiente.
4) il commento sul supermercato è fuoriluogo
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tirate in ballo diverse teorie, quella più semplice è anche quella più probabile.
Hai fatto una PCR con un solo protocollo... prima di lanciarti in teorie e protocolli complicati prova ad escludere gli errori più banali, verifica altre temperature di annealing o altri primers.
con questo chiudo
in bocca al lupo
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 22:19:06
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eleonora79
Nuovo Arrivato
Prov.: Viterbo
9 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2007 : 11:20:57
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| ..sinceramente nn sono molto esperta riguardo le tecniche di laboratorio cmq provo per logica a darti un suggerimento(anche se non so se e come potrebbe essere attuato!):prova ad utilizzare proteine che legano DNA a singolo filamento ,queste lavorando con la polimerasi stabilizzano la struttura a singolo filamento del DNA evitando la formazione di eventuali eliche a forcina che si potrebbero costituire per la casuale presenze di sequenze complementari sullo stesso filamento....(la speranza #232; l ultima a morire) |
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