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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
 Inserito il - 19 dicembre 2007 : 15:37:55
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Salve!!
ho un problema con un elettroforesi.
Dopo una miniprep, e successiva digestione del plasmide, ho fatto un elettroforesi x verificare la correttezza del plasmide.
Il campione di dna digerito, non migra su gel!!
esce appena dai pozzetti, ma non si muove + di tanto.
Il marker migra correttamente.
Ho provato ad estrarre il dna dal campione di miniprep, e fare successivamente la digestione, ma il risultato è identico.
Il dna nn migra.
Qualcuno sa darmi le possibili motivazioni??
Grazie in anticipo, ciao
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 16:18:54
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se non migra il dna dipende o dalla concentrazione del gel o dalla grandezza del plasmide/dna clonato.
se il vettore è un plasmide al max ci hai messo 30kb e questi devono correre su un gel 1%.
Considera che quando estrai DNA genomico e lo fai correre su un gel 1.2% questo si muove, rispetto al pozzetto, almeno di mezzo centimetro! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 16:28:49
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| forse perchè è il genomico? |
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 16:31:26
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bhe se hai clonato un genoma in un vettore... dimmi come hai fatto così ti propongo per il nobel  |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2007 : 21:28:05
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per estrarre il DNA genomico batterico è semplicissimo, anzi bisogna stare attenti a NON estrarlo.
basta agitare in modo un po' più vigoroso quando metti il lysis buffer (NaOH) durante l'estrazione oppure quando metti il terzo buffer (sodio acetato). Il DNA genomico si spezza un po' liberandosi dalle membrane plasmatiche e va a finire nel filtro della miniprep.
Il gioco è fatto hai il DNA genomico nell'eppendorf senza avere il DNA plasmidico perché la colonnina si è otturata per il DNA genomico. Se non mi credi puoi leggere le istruzioni o le avvertenze di qualsiasi kit di estrazione di miniprep o maxiprep, oppure puoi provare di persona.
E' l'errore classico che fa ogni bravo tesista alle prime armi, agita troppo vigorosamente durante l'estrazione.
In alternativa, caso raro ma non impossibile poiché è capitato a me, può verificarsi che il pettinino non lavato abbia un po' di etidio sulla superficie per cui marca i pozzetti del gel senza migrare.
rifai le miniprep
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2007 : 16:00:13
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Puoi dare qualche informazione in più? quanto dna hai usato? hai aggiunto bsa? in genere se eccessiva rallenta la corsa; se fosse DNA genomico, dopo la digestione (se ha funzionato) dovresti vedere uno smear e non una banda singola.
Ciao |
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2007 : 16:28:26
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| il plasmide è di 6820 bp, e il gel all'1%. L'unica possibile spiegazione è ke ci sia ancora dna batterico, ma dopo l'estrazione mi sembra impossibile... |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2007 : 18:06:57
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non tutti gli enzimi tagliano il genomico, e poi per i batteri non si vede mi uno smear, se tagliato il DNA genomico batterico appare come un marcatore di pesi molecolari con tantissime bande, provare per credere. Dovrei avere qualche foto conservata se servono esempi.
Se non tagliato appare come una banda che sta sotto il pozzetto e che migra con estrema lentezza come se fosse la banda di 23.000 basi di lambdaII.
Gli enzimi che sicuramente tagliano il genoma sono EcoRI e EcoRV (gli altri non li ricordo a memoria)
quelli che sicuramente non tagliano sono SmaI, ApaI, HindIII, XhoI, XmaI, ClaI, KnpI, PstI, MluI (per la lista completa devi cercare su internet o su un libro di metodologia)
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2007 : 18:22:31
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Si lo sapevo....intendevo dire che dovrebbe vedere non una ma più bande
Ciao |
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elettroforesi dna plasmidico
Didattica
