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Educcio
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: travagliato
17 Messaggi |
 Inserito il - 03 gennaio 2008 : 18:13:22
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Ciao a tutti, volevo chiedere se qualcuno avesse una idea di come fare a normalizzare i dati provenienti dai microarray.Ad esempio mettiamo che ho due chip su cui in uno metto gli RNA proveniente da cellule tumorali e nel secondo RNA di cellule di controllo: come faccio a confrontare le i rusultati delle 2 piastre?
Grazie e ciao 
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 03 gennaio 2008 : 21:59:08
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La Normalizzazione può essere effettuata attraverso diverse tecniche,che possono essere raggruppate in due tipologie:
a) Global methods
b) Reference Standards
a) Utilizzano i valori di espressione di diversi array,in modo da ottenere lo stesso valore di intensità media per ogni chip. Vengono soprattutto utilizzati per microarray di oligonucleotidi: in pratica è una normalizzazione che utilizza il livello mediano di espressione genica. Si ipotizza che il bias dipenda (in modo non lineare), dalla quantità assoluta di DNA presente negli spot e dai diversi pin (da Dudoit et al., 2002):
1) Global scaling
2) Modelli di regressione lineare sull’insieme dei dati di espressione
Tra i principali limiti vi è l’assunto implicito che diversi tipi cellulari presentino la stessa quantità di mRNA e che la relazione tra livello di espressione e bias (= gli errori sistematici) sia lineare.
b)Utilizzare un insieme di geni invarianti cioè tali che
1) i loro valori di espressione rimangano costanti su tutti gli array
2) i loro valori di espressioni ricoprano l’intero spettro di intensità del segnale osservato. (NB: Il fattore di normalizzazione necessario per aggiustare le intensità basse non necessariamente è uguale a quello utilizzato ad intensità elevate).
3) i rapporti di normalizzazione tra questi geni siano rappresentativi dei rapporti di normalizzazione per tutti i geni
A questo proposito si usa
- Housekeeping genes: geni scelti a priori in quanto si presume che non debbano variare il proprio livello di espressione nel corso dell’esperimento
- Livello di espressione mediana entro array: si suppone che almeno il 50% dei geni considerati non vari apprezzabilmente il proprio livello di espressione.
*Geni scelti a posteriori sulla base della loro espressione tra array: vengono selezionati come invarianti i geni il cui livello di espressione risulta simile tra i diversi array di un esperimento
*DNA eterologo di sintesi (geni sintetici a concentrazioni note)
La normalizzazione dei dati può essere effettuata sia livello di probe che a livello di gene’s signal (espressione). Irizarry et al.(2002) hanno dimostrato che normalizzare a livello di probe è più efficace rispetto alla normalizzaione sui valori di espressione.
Va inoltre ricordato che le repliche sono indispensabili per stimare la variabilità tra slides diverse, che è spesso quella di maggiore rilievo. Le repliche permettono l’applicazione di test statistici formali e l’individuazione di valori estremi (outliers) dovuti, ad esempio, alla presenza di contaminanti (pulviscolo) su qualche spot. Per la stima degli errori casuali le repliche biologiche risultano fondamentali; le repliche tecniche sono comunque utili per ottenere stime più precise. Il numero ottimale di repliche dipende comunque da diversi fattori, tra cui il tipo di array, le tecniche di laboratorio impiegate e le condizioni di preparazione dei campioni
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Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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normalizzazione dati da microarray
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