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Discussione |
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flavio
Nuovo Arrivato
Città: Roma
5 Messaggi |
 Inserito il - 05 gennaio 2008 : 09:13:00
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Salve a tutti. Ho un problema con una PCR: il controllo positivo viene spettacolare ma i campioni di mio interesse non vengono affatto! Il DNA è buono perchè se provo con altri primers vengono OK; il ciclo è settato perchè il + viene spettacolarmente OK...ho provato ad aumentare la quantità di dna dei campioni ma viene uno smirn di non amplificato....
Avete suggerimenti?
Grazie in anticipo
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 09:39:45
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Hai provato a fare una pcr diminuendo la Tm?
Puoi provare a farne anche una aggiungendo un po' di DMSO: aiuta a distendere i primer nel caso in cui formino strutture secondarie... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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flavio
Nuovo Arrivato
Città: Roma
5 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 14:44:34
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Si, uso DMSO al 5%.
Per la Tm: lavoro già a bassa temperatura, abbassandola ancora la situazione peggiora anche per il controllo positivo....
Cmq se il positivo viene benissimo, non cambierei le condizioni....
Help me!! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 15:00:05
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| Cosa usi come controllo positivo? E in cosa consistono i tuoi campioni? |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 15:55:19
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Caro flavio, forse sto per dire una grossa sciocchezza:
escludi la possibilità che questi tuoi campioni di DNA che non si amplificano hanno una delezione in omozigosi della regione che tenti di amplificare ?
fammi sapere
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flavio
Nuovo Arrivato
Città: Roma
5 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 22:08:17
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Citazione:
Messaggio inserito da valia
Cosa usi come controllo positivo? E in cosa consistono i tuoi campioni?
Il positivo è un campione di DNA che si amplifica bene. |
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flavio
Nuovo Arrivato
Città: Roma
5 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2008 : 22:12:52
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Citazione:
Messaggio inserito da aitan3
Caro flavio, forse sto per dire una grossa sciocchezza:
escludi la possibilità che questi tuoi campioni di DNA che non si amplificano hanno una delezione in omozigosi della regione che tenti di amplificare ?
fammi sapere
Beh, potrei pensarlo ma ci sono delle bandine che dire flebilissime è poco, il che potrebbe indicare che qualcosa si amplifichi (sono alla grandezza esatta...). Ma il positivo è veramente eccezionalmente bello... |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2008 : 00:28:22
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Citazione:
Messaggio inserito da flavio
Il positivo è un campione di DNA che si amplifica bene.
Eh, appunto! Intenedevo cos'e'?? Qual'e' la differenza tra controllo positivo e campioni? Usi DNA da individui diversi, o estratto in momenti diversi o di soggetti sani..? |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2008 : 01:35:13
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A questo punto per toglierti tutti i dubbi io ti consiglierei di cambiare oligo utilizzandone un'altra coppia di primers che si annilino in una regione immediatamente a monte rispetto alla coppia degli oligo che stai utilizzando in modo tale da verificare se è un problema di PCR o potrebbe trattarsi di un difetto genetico dei tuoi campioni.
Facci sapere come si concluderà questa vicenda.
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flavio
Nuovo Arrivato
Città: Roma
5 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2008 : 08:55:18
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Citazione:
Messaggio inserito da valia
Citazione:
Messaggio inserito da flavio
Il positivo è un campione di DNA che si amplifica bene.
Eh, appunto! Intenedevo cos'e'?? Qual'e' la differenza tra controllo positivo e campioni? Usi DNA da individui diversi, o estratto in momenti diversi o di soggetti sani..?
Sono DNA di individui diversi, senza evidenze di patologie...Sono di due etnie differenti |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2008 : 10:57:55
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Allora e' possibile che ci siano dei polimorfismi nella regione dei primer, per cui l'aligning non e' perfetto e la PCR ha una resa bassissima?
Come atan3, anch'io proverei un'altra coppia di primer! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2008 : 18:19:40
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Caro Flavio,
il fatto che la PCR sul DNA genomico esca bene con altri primers e probabilmente con altre temperature non è indice della buona qualità del genoma, poiché è noto che alcuni protocolli di PCR su genoma sono più robusti ed altri meno. Questa è una possibilità che tu non puoi escludere in alcun modo.
Io credo che dovresti prendere una serie di DNA genomico dello stesso tipo di quello che stai analizzando per il positivo, estraendo il DNA nello stesso modo e valutare il prodotto di PCR.
Se lavori bene ed ottieni 10 PCR su 10 controlli di DNA diversi allora puoi dedurre che c'è qualcosa di diverso nella sequenza dei campioni di DNA che non ti fa uscire la PCR.
Se invece su 10 DNA te ne escono 4-5-6 allora è probabile che sia un problema di estrazione.
Per valutare la qualità del DNA, almeno grossolanamente, hai due semplici metodologie a disposizione.
1) quella che preferisco. Carichi su gel di Agarosio 0,8% il DNA genomico e lo fai migrare lentamente.
Se il DNA è buono dovresti avere una sola banda all'altezza di 23kb (di Lambda II), altrimenti diverse bande più basse e nel peggiore dei casi uno smir.
2) Spettrofotometro con il rapporto 260nm/280nm Vedi protocollo Sambrook, oppure uno qualsiasi che trovi in un laboratorio.
Questo ti escluderebbe la possibilità di contaminazione da proteine o da lipidi in qualche caso.
Per il primo problema (DNA degradato) non c'è soluzione, devi riestrarre necessariamente.
Per il secondo problema invece puoi ripurificare il DNA oppure utilizzare una quantità molto inferiore di campione per non inquinare la PCR.
Una volta un professore mi faceva fare un protocollo strano per escludere le contaminazioni.
Credo che nel tuo caso si possa fare tranquillamente.
Se è X la quantità in ng di DNA che usi per fare la PCR, fai una mix di X/2 del DNA positivo e X/2 del DNA incognito per fare una PCR.
Se il problema è la contaminazione, la PCR non uscirà o verrà male.
Se il problema è la diversa sequenza la PCR uscirà normalmente come niente fosse.
in bocca al lupo.
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problema pcr
Didattica
