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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
 Inserito il - 08 gennaio 2008 : 20:08:00
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Ciao a tutti ed auguri per il nuovo anno!
X caso qualkuno fa real time di microRNA?
Fatevi vivi! 
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Farah |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2008 : 23:04:52
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Ehm  io si qualcuna ne ho fatta...
Cosa hai bisogno di sapere di preciso?
(Tieni conto però che non tutti i protocolli e i risultati con me al momento!)
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2008 : 13:41:33
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Carissima...solo ora leggo la risposta...volevo sapere qualcosa circa il disegno dei primers...nel senso...li hai disegnati tu? come se fosse x una RealTime di un qualsiasi altro gene oppure ti sei affidata alle mix già pronte ke trovi in vendita? Ed in questo caso..quale mi consigli?
Grazie mille. |
Farah |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2008 : 17:50:53
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Ciao!
In realtà il problema non è il disegno dei primers per la real time ma quello dei primers per la retrotrascrizione!
In genere si disegna un primer specifico con una coda oppure stem-loop, in modo che quando si retrotrascrive si ottiene un cDNA più lungo su cui si può fare una PCR.
La PCR viene fatta utilizzando un primer complementare alla sequenza del microRNA e l’altro complementare al primer di retrotrascrizione.
Io ho utilizzato due metodi uno con un kit già pronto della Ambion (mirVana qRT-PCR miRNA Detection Kit) che contiene il primer specifico per la retrotrascrizione e la mix per la RT e i primers per la PCR con la mix di PCR (puoi usarla sia per una end-point che per la real time, devi solo aggiungere SyBR Green che non è incluso e devi comprarlo a parte).
La mix di PCR dicono che è ottimizzata per l’amplificazione dei microRNA, in effetti ho provato a comparare la loro mix con quella che utilizzo normalmente e l’efficienza è sicuramente maggiore, hai amplificazione a cicli minori.
I primers per i vari micro-RNA (sia per RT che per PCR) li compri a parte, c’è una lista di primers disponibili: mirVana qRT-PCR Primer Sets.
Poi ho provato anche disegnando i primer per conto mio, disegnando un primer stem loop per la retrotrascrizione, i due primers per la Real Time e la sonda Taq-man (per rendere tutto più specifico). Esistono dei programmi apposta per disegnare i primer stem loop io non ce l’ho e in realtà il disegno dei primer me lo sono fatta fare!
In realtà sembrano funzionare entrambi, però io ho avuto dei problemi dovuti ad altri fattori. 
Il microRNA che stavo studiando nei controlli funzionava benissimo, ma nei miei campioni probabilmente è presente qualcosa di aspecifico ma molto simile e quindi ottenevo dei prodotti aspecifici!
Mi hanno detto che sono molto buoni anche i prodotti della Exiqon ma non li ho mai provati.
Ti posso consigliare due articoli che spiegano come fare:
Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.
Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs.
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2008 : 18:19:27
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Sei stata gentilissima...xkè hai confermato quasi tutto quello ke stava navigando tra i miei neuroni togliendomi il dubbio ke stessi facendo una cavolata..! Ank'io mi sto indirizzando verso i prodotti dell'Ambion ke hai usato tu..ed ora mi sto facendo un rapido conto e vedo ke ci vogliono circa 1000 euro..caspiterina..! 
Ma la tragedia vera è...a me serve di testare 2 miR..e per uno di essi vedo ke l'Ambion nn ha il set di primers...
Ma tu come normalizzatore hai usato U6?
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Farah |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2008 : 21:10:42
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No io per normalizzare ho utilizzato 5S perché era quello che indicavano sul manuale del mirVana™ qRT-PCR miRNA Detection Kit, però credo che U6 vada meglio.
Una cosa mi sono dimenticata di dirti però, adesso Ambion è stata acquistata da Applied Biosystems
Io ho cercato di contattare il servizio tecnico, ma non ho mai ottenuto risposta!!!
In Bocca al Lupo!
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 19:50:27
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Si lo so ke l'Applied ha fatto l'affare..e x quanto riguarda il servizio tecnico..se attendi una risposta via mail puoi anke morire...però se kiami ti rispondono..alle volte trovi anke un tipo competente..!
Altra domandina...nel kit è inclusa anke la Taq oppure devi comprarla a parte? Inoltre...mi sembra di aver letto ke il kit sia compatibile con tutte le Taq ke nn siano HotStart...tu come ti sei regolata?
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Farah |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 21:21:38
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Grazie, io avevo parlato anche direttamente con loro ad un corso... comunque sia adesso ho cambiato progetto e pure Paese e quindi non penso li contatterò!!!
Adesso che mi ci fai pensare la Taq non c'era e io ne ho utilizzata una che avevo già in laboratorio (invece la trascrittasi c'è!), la mia Taq non era hot-start e quindi non mi sono neanche posta il problema!
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 23:38:03
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Ti faccio sapere appena mi attivo...!
Sei stata carinissima! |
Farah |
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