| Autore |
Discussione |
|
|
zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
 Inserito il - 11 gennaio 2008 : 01:16:44
|
Salve.
Ho un problema con l'elettroforesi di una miniprep:
Ho trasformato dei batteri con il plasmide psv-Bgal della promega, 6820 bp, con resistenza all'ampicillina.
Fatta la miniprep di 4 colonie diverse, ho digerito il plasmide, e caricato 20microlitri di digestione su agarosio.
Ho caricato anke gli stessi campioni non digeriti.
I campioni non digeriti migrano perfettamente nelle tre forme plasmidiche, e non è presente dna genomico batterico (c'è un po' di rna di fondo).
I campioni digeriti invece hanno difficoltà ad uscire dai pozzetti, e migrano molto lentamente, e a non + di mezzo centimetro dal pozzetto.
Qualcuno saprebbe darmi una motivazione??
Il plasmide è stato digerito la prima volta con Hind III, e poi è stata fatta una prova con Eco R1 (ke avrebbe dovuto dare due frammenti di dna di circa 3000bp).
Gli ultimi 15 minuti delle due ore di digestione, ho aggiunto 1 microlitro di rnasi A.
Ho usato una quantità di dna sia si 3 microlitri, ke di 6.
Nn è un problema del gel, perchè il marker migra perfettemente.
Grazie in anticipo, ciao.
|
|
|
|
|
Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 12:59:46
|
Ciao,
percaso la tua corsa elettroforetica è di questo tipo??
|
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
 |
|
|
Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 13:29:37
|
Il primo è il marker,
la seconda posizione è non digerita,
le altre posizioni tranne l'ultima (che è un altro marker) sono digestioni.
Io mi sono fatto un'idea riguardo la scorretta migrazione dei digeriti...
...gli enzimi di restrizione sono vecchi o malconservati.
Tu cosa ne pensi?
Potrebbe essere anche che la deposizione non è stata corretta oppure l'errore è da imputare ai singoli pozzetti di gel di Agarosio ma non credo che siano questi i veri motivi...
Per voi qual'è il vero motivo?
Si accettano scommesse!!!
Lorenzo |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
|
|
|
Silvia2007
Nuovo Arrivato
Prov.: Viterbo
Città: viterbo
5 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 13:45:24
|
ciao a me capita spesso di fare miniprep e non ho mai avuto nessun problema se ti può aiutare di dico come faccio di solito:
Digerisco 3 ul di DNA con l'enzima di restrizione corretto, nel mio caso BamHI (1 ul) per 3 o 4 h a 37°C.
Dopodiche faccio correre il campione su un gel di agarosio 1% per 1h a 120 V
Una sola volta ho avuto un problema sull'estrazione di DNA ed avevo lasciato troppo terreno di coltura prima di mettere la soluzione di lisi..
ciao e psero di esserti stata di aiuto |
silvia |
|
|
|
zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 13:52:49
|
I pozzetti tre cinque e sette sono identici. Quelli cioè dove il campione non migra..
Il problema nn credo sia il gel: da me il marker migra perfettamente, ed anke il plasmide non linearizzato.
Ho provato due enzimi diversi, e mi sembra funzionino: il secondo doveva tagliare il plasmide in due parti, ed effettivamente, prolungando parecchio l'elettroforesi, se ne vedevano due, ma max a un cm dal pozzetto.
La migrazione la faccio a non + di 70 V però!! 120 mi sembrano eccessivi. Chiaramente se Anche questa volta non funziona, aumenterò parecchio il voltaggio.
Possibile ke sia l'rnasi A?? Io la metto gli ultimi 15 minuti di digestione. E' l'unico parametro ke attualmente non ho ancora cambiato.
Per ora sto estraendo il plasmidico col metodo fenolo-cloroformio dalle miniprep, in maniera da avere dna ancora più pulito.
Grazie delle risposta, vi faccio sapere... |
|
|
|
Silvia2007
Nuovo Arrivato
Prov.: Viterbo
Città: viterbo
5 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 15:13:51
|
ciao hai provato ad usare il tango buffer della fermentas?
per diluire l'enzima di restrizione?
Cmq se voi ti posso far vedere qualche foto di gel corsi a 120 V |
silvia |
|
|
|
zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2008 : 16:35:40
|
Per gli enzimi uso già i loro buffer, li prendiamo assieme...
ho usato nella prima digestione:
1 microlitro Hind III
3 " " dna
2 " " buffer 10x
14" " acqua
e due ore di digestione. Alcuni protocolli dicono anche 45'..
durante ultimi 15', metto l'RNAsi A.
ma se metti a 120V, il marcatore non ti esce fuori?? Io uso il ladder mix, da 10000 Bp a 500.. |
|
|
|
moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2008 : 12:47:12
|
Citazione:
Messaggio inserito da zelos1
La migrazione la faccio a non + di 70 V però!! 120 mi sembrano eccessivi.
Il voltaggio dipende dalle dimensioni dell'aparato.Ci sono 3 diversi gel tank (credo!), piccolo, medio e grande.
Ilpiccolo lo mando a 60-70 Volt, il medio fino a 100, il grande fino a 150.
Diepende dalla casa produttrice.
Per la digestione non so cosa dirti perchè a mio avviso se l'enzima è stao conservato male allora non dovrebbe più tagliare e dovresti trovare delle bande uguali al non digerito...non capiso poi perchè il campione non esca dal pozzetto
Bha! Facci sapere |
|
|
|
Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2008 : 16:26:50
|
| Il Bam HI io lo tengo anche overnight a digerire,purtroppo ho riscontrato che la sua efficienza non è eccezionale.Basta cambiare di poco qualche parametro e subito ci son problemi. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
|
|
|
zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2008 : 17:46:28
|
purificando il dna plasmidico, fenolo cloroformio, e digerendo nuovamente con ecoR1, le bande di uno dei due campioni sono venute perfette.
L'ipotesi + probabile è quindi ke ci sia un problema di contaminazione. La miniprep insomma è molto sporca. Forse le soluzioni stet e ten sono troppo vecchie, non so...
La cosa strana è ke uno dei due campioni dopo estrazione del dna plasmidico, quindi dopo essere stato ulteriormente purificato, si sia bloccato nel pozzetto.
Bho. Cmq, un campione pulito per la maxi l'ho ottenuto, caso + o meno chiuso...
|
|
|
| |
Discussione |
|
miniprep-digestione-elettroforesi
Didattica
