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123Vale
Nuovo Arrivato
57 Messaggi |
 Inserito il - 21 gennaio 2008 : 10:51:53
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Ciao, è indifferente inserire il bromuro d'etidio nella soluzione del gel prima della corsa elettroforetica o dopo che sul gel è già avvenuta corsa?Da un mio lab mi risulta che:
per preparare il gel d'agarosio è stato inserito nella soluzione, mentre per il gel di poliacrilammide, dopo corsa, è stato inserito immergendo il gel in una soluzione di bromuro d'etidio.
Se è nella soluzione del gel,intercalandosi tra le basi non ostacola o impedisce la corsa del mio DNA?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 13:13:14
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Citazione:
Se è nella soluzione del gel,intercalandosi tra le basi non ostacola o impedisce la corsa del mio DNA?
No. Lo puoi addirittura mettere direttamente nel campione e funziona lo stesso :) |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 18:53:33
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Citazione:
Messaggio inserito da 123Vale
Ciao, è indifferente inserire il bromuro d'etidio nella soluzione del gel prima della corsa elettroforetica o dopo che sul gel è già avvenuta corsa?Da un mio lab mi risulta che:
per preparare il gel d'agarosio è stato inserito nella soluzione, mentre per il gel di poliacrilammide, dopo corsa, è stato inserito immergendo il gel in una soluzione di bromuro d'etidio.
Se è nella soluzione del gel,intercalandosi tra le basi non ostacola o impedisce la corsa del mio DNA?
Non interferisce con la corsa ma intercalandosi fra le basi ne modifica il twisting quindi cambia la topologia del DNA...ovvio che è importante se a te interessa valuatare lo stato di superavvolgimento...se hai invece frammenti di DNA non ha importanza. |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 19:27:20
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| In effetti il bromuro di etidio può essere usato già nella preparazione del gel ma bisogna ricordarsi sempre della sua tossicità (è cancerogeno), dunque meno si è a contatto meglio è! cmq oggi si lavora sotto cappa quindi i rischi sono minori.Se valutiamo la corsa di un campione di dna circolare però è meglio tener conto del fatto che l'EtBr introduce supercoil positivi e quindi tende a rilassare le molecole di ccDNA supercoil negativamente. Ciao |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 18:26:16
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Cara 123Vale,
Tecnicamente non c'è nessuna differenza tra il mettere l'editio nel gel prima o dopo la corsa...
la differenza è basata sulla praticità... prova a mettere l'editio nel gel di acrilamide prima della solidificazione e vediti il gel dopo la corsa... non troverai più l'editio poiché se n'è andato.
Le maglie dell'acrilamide sono molo più strette rispetto al gel di agarosio e l'etidio per cromatografia ad esclusione molecolare migra molto più velocemente al lato opposto rispetto al tuo DNA... poi conta che lo spessore del gel è molto più piccolo e quindi per diffusione l'etidio può anche uscire dal gel ed andare in soluzione...
Risultato... in poco tempo non trovi più etidio nel gel e soprattutto il gel è disomogeneo poiché anche i campioni che hanno intercalato l'etidio incominciano a perderlo per strada. In pratica il DNA grande ha ancora etidio e si vede, mentre i campioni piccoli che hanno migrato molto di più e che restano più tempo in assenza di etidio lo perdono e non si vedono facilmente.
Risultato meglio fare lo staining dell'acrilamide dopo e vederlo con la lampada UV a riflesso piuttosto che per transilluminazione. Questioni pratiche 
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 20:44:50
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Come ti hanno detto non ci sono poi molte differenze. Personalmente preferisco staining successivo, credo che abbia i suoi vantaggi, ma nel lab dove ho da poco iniziato il dottorato non hanno questa abitudine e non c'è verso di fargli almeno provare il sistema.
I vantaggi che a mio avviso ne derivano sono:
- si isola in uno spazio minimo l'attrezzatura contaminata
- il gel è colorato in maniera uniforme (per il solito motivo che l'EtBr migra nel verso opposto
- puoi preparare una quantità maggiore di gel che potrai risogliere quando ti serve, e nel frattempo lo tieni in bottiglia
- non rischi di contaminare la pipetta con la quale poi devi lavorare anche in altri momenti
Forse tra un po' diventerò più influente e gli farò cambiare idea! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 21:33:58
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Citazione:
Messaggio inserito da Ayla
Come ti hanno detto non ci sono poi molte differenze. Personalmente preferisco staining successivo, credo che abbia i suoi vantaggi, ma nel lab dove ho da poco iniziato il dottorato non hanno questa abitudine e non c'è verso di fargli almeno provare il sistema.
I vantaggi che a mio avviso ne derivano sono:
- si isola in uno spazio minimo l'attrezzatura contaminata
- il gel è colorato in maniera uniforme (per il solito motivo che l'EtBr migra nel verso opposto
- puoi preparare una quantità maggiore di gel che potrai risogliere quando ti serve, e nel frattempo lo tieni in bottiglia
- non rischi di contaminare la pipetta con la quale poi devi lavorare anche in altri momenti
Forse tra un po' diventerò più influente e gli farò cambiare idea!
Si va beh io invece sono a favore del mettere l'Etidio direttamente nel gel (intendo per i gel di Agarosio ovviamente!  )
- isoli comunque in uno spazio minimo l'attrezzatura contaminata (con le dovute precauzioni)
- puoi preparare comunque una quantità maggiore di gel da risciogliere quando ti serve... basta che aggiungi l'etidio solo ad alla parte che ti serve messa in un contenitore che utilizzi solo per quello
(anche se mi è capitato anche di andare in un laboratorio dove mettevano l'etidio nella beuta con tutto il gel e poi lo riscioglievano nel microonde e se lo portavano tranquillamente a spasso per il laboratorio!!! )
- il procedimento è molto più veloce che non stare a colorare dopo
- non hai tutta quella soluzione di Etidio!!! Che a me proprio non piace e che è peggio da smaltire rispetto ad un gel solidificato
- la pipetta comunque usando i puntali non ho così facile da contaminare, basta un po' di attenzione che ci vorrebbe in ogni caso!
Potremmo fare una discussione infinita sui pro e i contro...
Comunque mi sembra che l'unica risposta che spieghi le "vere" motivazioni sia quella di Neuroscience!!
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Bromuro d'etidio
