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Autore Discussione  

Tati_biologa
Nuovo Arrivato

Città: Roma


4 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 13:33:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tati_biologa Invia a Tati_biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,
mi sono appena iscritta al forum perchè l'ho trovato molto utile e costruttivo. Io sono una dottoranda in biologia evoluzionistica a roma e mi occupo di filogenesi. Lavoro su dna di lepidotteri conservati a secco (le famose collezioni di farfalle ) Quindi spesso mi trovo a "combattere" con dna molto mal ridotto. Ultimamente ho molti problemi per avere amplificati buoni...già provato ad abbassare annealing, aumentare magnesio, usare BSA o betanina. Qualche suggerimento?
Grazie mille e....aiutatemi!!

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 14:31:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova ad aggiungere DMSO o a cambiare Taq o quantità di DNA
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Tati_biologa
Nuovo Arrivato

Città: Roma


4 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 19:57:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tati_biologa Invia a Tati_biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per il suggerimento. A cosa servirebbe esattamente questo DMSO? Per quanto riguarda tentativi sulla quantità di DNA già ho fatto diversi tentativi fallimentari. Il bello è che continuo a lavorare sempre sulle stesse cose e usando gli stessi protocolli e ingredienti (in realtà utilizzo la MasterMix della Promega)improvvisamente non viene più nulla...mistero!
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 19:59:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova a riordinare i primers, alcune persone congelano e scongelano più di 4-5 volte i primers ed è ovvio che non ti esce più niente... idem per i nuncleotidi, mai congelare e scongelare più volte. Fatti delle aliquote.
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Tati_biologa
Nuovo Arrivato

Città: Roma


4 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 20:03:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tati_biologa Invia a Tati_biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma allora perchè i controlli positivi vengono? Non credo sia un problema di primers...altrimenti non verrebbero nemmeno i C+. E comunque ho la buona abitudine di aliquotare tutto proprio per evitare questi problemi. Le ho pensate tutte...
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darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 20:03:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se non sbaglio il DMSO dovrebbe avere un'azione di stabilizzazione del legame Taq-DNA. io lo uso al 3%. per quanto riguarda la taq, anche io faccio delle PCR standardizzate su dei pazienti usando la Promega. delle volte però ho dei problemi dovuti probabilmente a campioni di DNA non ottimali (mi arrivano da diversi posti del mondo e viaggiano tanto). questi problemi li ho risolti abbastanza bene utilizzando la FastStart Taq della Roche. quello che ti consiglio è fare delle prove.
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Tati_biologa
Nuovo Arrivato

Città: Roma


4 Messaggi
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 20:06:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tati_biologa Invia a Tati_biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie...proverò ad utilizzare questo DMSO e questa Taq che mi dici. Vediamo se riesco ad amplificare questo DNA. Ma che metodo di estrazione usate? Io sto cercando quello che sia in grado di darmi la resa maggiore, lavorando io purtroppo con DNA abbastanza vecchio su campioni secchi
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