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Isadora
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 25 gennaio 2008 : 17:45:51
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Scusate, sono nuova e devo dare fra poco un esame di biologia molecolare  , quindi temo che vi assillerò di domande. comincerò subito con due. qualcuno può spiegarmi x favore a proposito del northern blot cosa si intende per normalizzazione con controllo interno??? inoltre qualcuno può gentilmente spiegarmi il dot blot?? i processi passo x passo e la differenza con gli altri "blot"?? grazie in anticipo a chi mi aiuterà! 
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 19:26:36
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Cara Isadora,
in generale per controllo interno si intende un gene, una proteina o una qualsiasi cosa che deve essere facilmente misurabile con la tecnica che utilizzi e che non varia in funzione dell'esperimento che stai facendo... ad esempio se utilizzi un farmaco e vuoi valutare l'espressione genica, il tuo controllo interno sarà un gene espresso nelle cellule che analizzi e che non cambia di espressione in funzione del trattamento farmacologico.
Ovvio che se non trovi quello che stai cercando devi anche dimostrare che eri in grado di analizzarla in maniera corretta e questo si fa con un controllo interno.
Normalizzare significa dividere il valore ottenuto dal tuo gene/proteina/mRNA per il valore ottenuto dal tuo gene/proteina/mRNA del controllo interno nella stessa popolazione cellulare.
Questo serve per rimanere indipendenti dalla quantità di cellule o la bontà della tua estrazione, in poche parole se pipetti un po' più di cellule, proteine o altro avrai dei valori più alti e viceversa.
Per evitare questo si "normalizza" (ovvero dividi i valori ottenuti per un valore che dipende dalla sola quantità di proteine/cellule/mRNA totale).
Se non fosse chiaro potrei fare un esempio
Vorrei verificare che l'aspirina aumenti la quantità della proteina Anidrasi in cellule.
Divido la popolazione delle cellule in due, da una parte metto l'aspirina e dall'altra no.
Poi estraggo le proteine e verifico quanta Anidrasi c'è in una popolazione e poi nell'altra.
Anche se sembra giusta la procedura, manca la prova che le due popolazioni erano composte dallo stesso numero di cellule, o che l'estrazione proteica in entrambe le popolazioni abbia avuto la stessa resa.
Il modo corretto di fare questo è analizzare la quantità di Anidrasi e dividerla per un controllo interno che so già che non varia nel corso dell'esperimento, es Actina.
Divido ogni valore ottenuto dall'anidrasi per la propria l'actina (normalizzazione). Ottengo quindi un rapporto Anidrasi/Actina che è indipendente dal numero di cellule che ho analizzato, dalla resa dell'esperimento o dalla mia capacità di riprodurre lo stesso esperimento.
Ovviamente la scelta del controllo interno più opportuno per il tuo esperimento è il punto chiave.
2) Il dot blot è una tecnica simile al western/northen/southern blot, ma la migrazione è fatta con quantità di campione molto minime e sono posizionati in pozzetti molto piccoli per cui compaiono come punti, le applicazioni sono molteplici. Nel northen non si usa molto, ma nel Southern si usa per screenare batteri che hanno acquisito un particolare DNA, oppure nel western blot si usa per avere una maggiore definizione/risoluzione delle bande, magari associato con una corsa bidirezionale.
3)
Northen blot = quantizzazione dell'RNA mediante sonda a DNA
si usa per quantizzare un mRNA, verificare se aumenta o diminuisce e più frequentemente verificare se un mRNA si trova o no in un particolare tessuto
si estrae l'RNA dai tessuti, si fa migrare in un gel denaturante, poi si passa per migrazione veticale su in filtro di nitrocellulosa e si ibridizza con una sonda radioattiva o luminosa.
Sothern blot = quantizzazione del DNA mediante sonda a DNA
non si usa mai per quantizzare il DNA in realtà, ma si usa solo per verificare se esiste una banda di DNA che contiene una sequenza specifica, oppure per verificare la distanza di una data sequenza da un sito di restrizione vicino.
L'applicazione più frequente è di tipo genetico, ovvero animali transgenici che hanno o no integrato un pezzo di DNA esogeno, oppure verificare se in un determinato esperimento è uscito o no una banda che ha una particolare sequenza es PCR.
si estrae il DNA dai tessuti o dalla PCR, si fa migrare in un gel di agarosio, poi si passa per migrazione veticale su in filtro di nitrocellulosa e si ibridizza con una sonda radioattiva o luminosa.
Western blot = quantizzazione di proteine mediante sonde (anticorpi)
si usa per quantizzare l'espressione proteica
si estrae le proteine dai tessuti o cellule, si fa migrare in un gel di acrilamide, poi si passa per migrazione veticale su in filtro di nitrocellulosa e si ibridizza con una sonda primaria che riconosce solo la proteina che ti interessa, poi usi una sonda secondaria chemioluminescente che si lega alla sonda primaria.
Alla fine in genere hai sempre una lastra in cui sono presenti (si spera) delle bande a particolari altezze rispetto a dei marcatori o controlli interni.
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Isadora
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 19:36:31
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 grazie mille!!!! utilissimo!!!! |
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