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biotecman
Nuovo Arrivato

40 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2008 : 18:05:44

scusate nuovo dubbio...nuova domanda

1) perché nella preparazione di un gel agarosio-formaldeide, si scioglie prima l'agarosio in acqua e POI si mette il tampone con il MOPS e la formaldeide(per il DNA sciogliamo l'agarosio direttamente nel tampone)

2)perché nel loading buffer è contenuto sia formaldeide che formammide deionizzata (non hanno entrambe la stessa funzione denaturante contro le strutture secondarie dell'RNA?)

3) perché l'edidio bromuro viene messo nel loading buffer e non nel gel (come nell'elettroforesi del DNA) e come fà ad intercalarsi se l'RNA è a singolo filamento?

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2008 : 00:27:51

1) la formaldeide è molto volatile per cui durante l'ebollizione del gel si allontana quasi del tutto
Il MOPS invece si può mettere anche prima, io in genere faccio così.

2) esistono diverse sostanze denaturanti, associarne alcune può migliorare la denaturazione, sebbene a volte si associano per migliorarne le caratteristiche.

3)il motivo è che l'etidio bromuro in presenza di formaldeide emette una fluorescenza molto forte, aumentando quindi il rumore di fondo del gel.
Caricando l'etidio solo nel loading si limita la fluorescenza ai soli campioni
Anche l'RNA a singolo filamento, come il DNA si ripiega su se stesso almeno in parte, l'altra parte invece interagisce con l'etidio con forze deboli o ponti ad idrogeno, quindi sebbene meno efficiente, si lega comunque al DNA/RNA a singolo filamento.