Ciao a tutti ho qualche problema con la separazione a partire da sangue...non riesco a capire perchè ma perdo un sacco di materiale e mi ritrovo pochissimi leucociti....non riesco a capire se siano necessarie diluizioni del sangue prima della stratificazione con FICOLL...se invece sia un problema di centrifugate o se invece sia necessario lavorare in ghiaccio....qualcuno di voi ci lavora spesso e ha anche una buona resa?Se si a quanto corrisponde più o meno?
Il fatto è che spesso sono costretta a procedere con la separazione il giorno dopo il prelievo e in questi casi tengo il campione a 4°C finchè non lo utilizzo...e poi ho un viaggio in macchina di circa un'ora e non so se la temperatura ambiente influenza ed è meglio utilizzare una borsa frigo....qualcuno sa aiutarmi per favore?
io per la mia tesi ho lavorato con linfociti umani. Le separazioni le ho sempre fatte col Lympholyte ma le rese dipendevano dal sangue, ma non ho mai fatto una media per capire quante cellule riuscivo ad estrarre ad ogni isolamento. In ogni caso il campione lo diluivo con PBS 1:1 e durante l'isolamento lavoravo sotto cappa e non in ghiaccio, anche se il buffy coat lo tenevo in camera fredda a 4°C. Anche nel mio caso il sangue era fornito da un ospedale che si trova ad un paio di km dall'università e nel trasporto il campione l'ho sempre tenuto in ghiaccio, all'interno di un recipiente di polistirolo. E' possibile che nel trasporto il campione si degradi e che le rese di conseguenza diminuiscano.
Io faccio così Parto da buffy-coat, distribuisco 15ml di sangua circa per falcon da 50ml. Poi lavo la sacca con fisiologica e metto quest'ultima nelle falcon dove c'è il sangue dividendola equamente. Alla fine porto tutto a 50ml (cioè ho 4 falcon di 50ml piene). Centrifugo 1200 rpm 10 minuti mettendo il freno a 2 (cioè quasi senza freno). Tolgo quindi buona parte del siero e allungo il pellet con fisiologica fino a 35ml per ogni falcon. Poi stratifico i 35 ml su 15ml di Ficoll e centrifugo a 1650 rpmper 30 min con accelerazione e freno a zero. L'anello che recupero sopre il Ficoll sono Monociti e Linfociti.Lavo una volta con fisiologica a 1650 rimettendo freno e accelerazione e due volte a 900 rpm per togliere le piastrine. Tieni ovviamente sempre il pellet. Anch'io cmq ricevo il sangue da un ospedale a nord di Milano mentre io lavoro a sud di Milano, lo trasportano però in una borsa termica a +4C. Separo lo stesso giorno perchè ho sentito che il giorno dopo la resa si abbassa soprattutto per i monociti.