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Discussione

mira
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2005 : 20:28:19

ho un plasmide con un gene di trypanosoma da amplificare. L'amplificazione toglier� un pezzo del gene di 500bp, quindi devo ricircolarizzare l'amplificato e utilizzarlo per una elettroporazione.
Il problema � avere un amplificato pulito e senza smirring dovuto alla circolarizzazione del substrato. Che posso fare? aumentare il tempo della Ta e poi?

dallolio_gm
Moderatore

Prov.: Bo!
Citt�: Barcelona/Bologna

2445 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2005 : 20:31:48

smearing...

Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-)

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2005 : 23:18:31

Aumentare il tempo di annealing potrebbe aumentare lo smearing...
Piuttosto aumenta la temperatura di annealing (procedi a step di 0.5 gradi e vedi quando viene pulito). Ovviamente se il termocycler che stai usando puo' fare gradienti di T tra i pozzetti tutto sara' piu' facile!

Se cosi' non funziona potresti fare una nested PCR (usi prima dei primers piu' esterni di quelli che stai usando ora e poi amplifichi l'amplificato con i tuoi primers).

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