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ginetto
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 Inserito il - 03 febbraio 2008 : 19:46:40
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Salve gente.
E' da 1 anno e mezzo che cerco di esprimere e purificare piccole proteine (50aa) a sequenza casuale e quindi non naturali.
Come vettori ho usato un plasmide derivato dal pUC (credo) e il pET14b, diversi ceppi cellulari come BL21(DE3)pLys, BL21-AI, DH5alpha, XL1Blue, JM109.
Col il primo vettore la proteina ha sequenza leader pelB per il trasporto verso lo spazio periplasmatico e histag per la purificazione. Inoltre, in particolari ceppi, può essere espressa come proteina di fusione alla proteina III del fago filamentoso M13.
Con il secondo vettore la proteina ha solo l'histag.
Abbiamo fatto molte prove di espressione e purificazione senza alcun risultato! :-(
Le cellule sono state indotte con IPTG 1mM (BL21-AI richiede anche Arabinosio 0,2%), a diverse temperature (20, 30, 37°C) e per tempi diversi (3ore e over night). Ma non vi è nessuna banda evidente di espressione.
Si sono tentate purificazioni con biglie magnetiche al nickel che chelano le istidine e colonne al nickel.
Con il pET14b sono stati fatti diversi western blot ed espressione in vitro con e senza metionina radioattiva.
Tutto senza alcun risultato evidente.
Avete qualche consiglio o idea?
Se vi serve qualche dato che ho omesso, chiedete pure.
Se queste proteine non vogliono saltar fuori almeno vorrei illustrare le possibili problematiche per la loro scarsa o nulla espressione.
HELP ME!!
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Espressione e purificazione di piccole proteine.
Didattica
