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Autore

Discussione

metionina
Nuovo Arrivato

Citt�: Cambridge

45 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 17:05:12

ciao a tutti!
una domanda: i primers che si usano nella PCR sono fosforilati in 5'? o normalmente gli oligo sintetici presentano 5'OH e 3'OH? mi sono posta la domanda perch� il metodo per il clonaggio in vettori blunt-ended non fosforilati di prodotti di PCR (come pMOS per capirci) prima della ligazione al vettore presentano una fase di fosforilazione dell'inserto...
grazie a chi pu� rispondermi!!

Schuldiner86
Utente Junior

Prov.: Viterbo
Citt�: Bologna

581 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 18:25:14

Per puro caso ho appena letto per il TA Cloning dal libro "From Genes to Genomes" che gli oligo sintetici non sono fosforilati al 5'...

Silvy
Nuovo Arrivato

Prov.: Bergamo
Citt�: Trescore Balneario

26 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2008 : 19:37:55

Esatto, non sono fosforilati al 5'...Purtroppo ne so qualcosa, nel senso che lo scorso anno, mentre facevo un clonaggio blunt, inizialmente defosforilavo il vettore senza tener conto del fatto che gli oligo per amplificare l'inserto fossero defosforilati al 5'

Il problema di attuare un clonaggio di questo tipo � che durante la ligazione, molti vettori, non essendo defosforilati, si chiuderanno su s� stessi e quindi avrai molte colonie trasformate dal solo vettore senza inserto...
Cmq c'� sempre l'opzione di acquistare oligo fosforilati al 5' (ovviamente costeranno di pi�)oppure di fosforilare l'inserto ottenuto.