| Autore |
Discussione |
|
|
cimemole
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2008 : 20:50:32
|
Salve a tutti, mi piacerebbe avere unn consiglio per quanto riguarda contaminazioni di DNA in campioni di RNA.
Io generalmentre tratto i miei campioni con DNase I per eliminare l'eventuale genomico presente, però il problema è un altro: siccome ho estratto l'RNA da cellule trasfettate, ho contaminazione di DNA plasmidico; me ne accorgo perchè quando faccio real time sull' RT -, ho comunque amplificazione, e non può essere contaminazione di DNA genomico, perchè i primers sono scelti a cavallo tra gli esoni, quindi sono giunta alla conclusione che ho contaminazione di DNA plasmidico che non riesco ad eliminare con trattamento con DNase I.
Potreste darmi qualche consiglio??? Ci sto davvero perdendo del tempo...ed ho necessariamente bisogno di avere risultati!!!
Grazie mille,
Cinzia
|
|
|
|
|
cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2008 : 08:22:58
|
Di che ditta è la DNAse I?
Con cosa estrai l'RNA? |
 |
|
|
cimemole
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2008 : 12:39:23
|
La DNase I è della Roche, ed estraggo l'RNA con il Trizol (Invitrogen)
Citazione:
Messaggio inserito da cin
Di che ditta è la DNAse I?
Con cosa estrai l'RNA?
|
|
|
|
Luca Beretta
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:04:37
|
Ciao,
con cosa stai facendo Real Time? TaqMan o SYBR Green? Perchè se hai segnale con il SYBR possono essere semplicemente dei dimeri di primer (basta diminuire la concentrazione dei primer).
E poi occhio, anche se costruisci un saggio a cavallo di giunzione esone/esone, se l'introne è piccolo il saggio può detectare anche il genomico!
Per il trattamento con DNase prova la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907
Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC)
Ciao |
|
|
|
Luca Beretta
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:06:03
|
DNase I non è solo di Roche, anzi!
Per il trattamento con DNase provate la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907
Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC). AM9738
Ciao |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 10:50:13
|
Luca, ma per caso lavori per AB? (me lo chiedo visto che in tutti i tuoi messaggi continui ad elogiarli)
Ora, non è che abbiamo problemi di sorta a mettere sul forum pareri sui vari prodotti delle varie marche, però gentilmente cerchiamo di limitare la pubblicità gratuita... |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
Luca Beretta
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:00:42
|
 No no, solo utilizzo i loro prodotti da una vita e mi trovo bene.
va bene non vi darò più i codici, al limite chi li vuole ne parliamo via mail.
 |
|
|
|
Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:11:42
|
concordo
ciao
 |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:44:18
|
Citazione:
No no, solo utilizzo i loro prodotti da una vita e mi trovo bene.
va bene non vi darò più i codici, al limite chi li vuole ne parliamo via mail.
Don't worry, scrivi pure i codici non è un problema è solo che mi ero appena letto 5 o 6 dei tuoi messaggi ed avevo avuto questa impressione! 
PS: benvenuto sul forum! |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
cimemole
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 22:31:22
|
Wow, grazie dei consigli...Cmq gli oligo sono scelti a cavallo, ma con introni molto grandi in mezzo.
Invece per la Real Time uso il Sybr Green e non credo si tratta di dimeri di primers perchè ho dei picchi di dissociazione alla stessa Tm del mio campione di interesse.
Cmq grazie per i consigli sui prodotti, ne parlerò con le altre persone del lab
Ciao
Citazione:
Messaggio inserito da Luca Beretta
Ciao,
con cosa stai facendo Real Time? TaqMan o SYBR Green? Perchè se hai segnale con il SYBR possono essere semplicemente dei dimeri di primer (basta diminuire la concentrazione dei primer).
E poi occhio, anche se costruisci un saggio a cavallo di giunzione esone/esone, se l'introne è piccolo il saggio può detectare anche il genomico!
Per il trattamento con DNase prova la Turbo DNase di Ambion (Applied Biosystems), è 400 volte più efficiente nella rimozione del DNA rispetto ad una normale DNaseI. In più ha una stop solution, non devi più nemmeno inattivare l'enzima con il calore! AM1907
Ah, un consiglio... il Trizol di Invitrogen costa uno sproposito ed è assolutamente identico al Tri Reagent di Ambion, che costa quasi la metà. E' identico, non simile (Ambion e Invitrogen sono solo rivenditori del prodotto, lo produce la MRC)
Ciao
|
|
|
| |
Discussione |
|
DNase I
Didattica
