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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2008 : 11:57:07
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Ho un problemino... devo sequenziare delle bande da gel ma con il mio medoto di estrazione penso di andare ad interferire con il sequenziamento e non mi viene nulla. Voi che protocollo utilizzate per estrarre da gel per avere poi dei bei cromatogrammi?
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Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2008 : 16:50:45
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Io utilizzavo un kit della QIAGEN per estrazione da gel (il nome esatto non lo ricordo ma se vuoi posso cercarlo!), penso che però siano più o meno tutti uguali.
E le sequenze erano belle!!!
Tu che metodo usi?
Sicuro che il problema non sia una degradazione del DNA?
Come fai per excidere la banda da gel? Lo tieni tanto sugli UV?
Io usavo questo metodo che ho descritto qua:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2058
mi autocito 
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
P.S. per quanto riguarda l'esposizione del gel agli UV io uso un altro metodo:
Semino parte della reazione di PCR in un pozzetto piccolo e tutto il resto in uno grosso (ottenuto come dice Valia unendo i pozzetti con lo scotch), poi taglio il gel verticalmente in mezzo tra pozzetto piccolo e pozzetto grosso.
Porto solo la parte con il pozzetto piccolo sopra gli UV e excido la banda che mi interessa. Poi lontano dagli UV riconpongo il gel ed excido la banda (allo stesso livello) anche dal pozzetto grosso... così il pezzo che recupero non viene minimamente esposto agli UV!!!
Infine per controllare porto tutto il gel rimasto sotto gli UV e controllo che non sia rimasta la banda su gel!
E' un po' laborioso e ti porti dietro un po' più di agarosio... però eviti il contatto del DNA con gli UV!
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 17:28:17
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| grazie 1000. |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 17:38:46
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Il mio metodo è:
- aggiungo una soluzione 3M NaI, 4M NaClO4, 5mM Tris/HCl, pH7.5 0.1% Na2SO3;
- 55°C x 10';
- aggiungo silice 5ul;
- 15' a RT;
- centrifugo per formare appena un pellet;
- lavo il pellet con 2-3 volte con un wash buffer con EtOH
- risospendo il pellet in acqua dopo centrifugazioni di 12sec a 13000rpm.
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Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:38:11
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| io l'ho fatto diverse volte e anche io ho avuto notevoli problemi di sequenza, ho ipotizzato che nelle varie centrifugate su filtro, parte del filtro si staccasse e andasse a finire nel DNA, interferendo nella reazione di sequenza. Così ho deciso di centrifugare il campione ottenuto per 4-5 min 13000 rpm RT e di portare il campione in un'altra eppendorf, ipotizzando lo spiaccicamento dell'eventuale resina staccatasi sul fondo dell'eppendorf. Può sembrare stupido, ma da quando faccio così non ho mai problemi |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Discussione |
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Sequenziamento da banda
Didattica
