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Discussione |
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vanessa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2008 : 08:41:39
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ciao, mi chiedo se sia possibile che dei primer che funzionano bene su tessuto non vadano bene per le cellule ottenute proprio da quel tessuto.
Vanessa
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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vanessa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 11:59:01
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dunque...io ho del tessuto muscolare dal quale ho estratto l'rna, retroscritto e amplificato per il gene dell'adiponectina e per questa pcr semiquantitativa ho usato dei primer presi da un lavoro. Poi da quel tessuto abbiamo ottenuto le cellule muscolari dalle quali ho estratto l'Rna, retrotrascritto e amplificato sempre per il gene dell'adiponectina usando gli stessi primer usati per il tessuto, solo che non vedo nulla! è possibile che questi primer non vadano bene per le cellule, ma solo per il tessuto? ho già eliminato quelli che potevano essere problemi di reazione...boh! spero di essere stata più chiara!
Grazie
Vanessa |
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mentecorda
Nuovo Arrivato
Prov.: Taranto
Città: palagiano
21 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 14:51:47
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| Cosa mi dici di trattamenti con dietilpiroarbonato, o inibitori vari, come quelli estratti dalla placenta? Il trascrittoma è molto molto labile, non vorrei che si fossero liberate molte più proteine ad attività rnasica in seguito alla rottura del tessuto...lavorando a bassissime temperature si può evitare questo inconveniente, ma poi risulterebbe inadeguata la condizione di T in cui stai usando l'SDS...insomma, la mia risposta è NO, non è possibile che una coppia di primers vada bene per i tessuti e non per le cellule.A mio parere... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 15:27:59
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| Ma hai provato a fare l'amplificazione anche con altri primers, tipo geni "housekeeping" per vedere che non sia un problema dell'RNA? |
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vanessa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 15:56:18
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Si ho amplificato sia per geni housekeeping sia per altri geni target e l'Rna funziona, è solo per il gene dell'adiponectina che ho una incongruenza tra tessuto e cellule!
vanessa |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2008 : 22:26:28
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| Scusa la mia massima ignoranza... i miociti esprimono l'adiponectina? Perchè quando estrai da tessuto ci sono altri tipi cellulari oltre ai miociti... |
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vanessa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2008 : 10:13:39
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Da letteratura la linea cellulare C2C12 produce adiponectina, in più noi abbiamo fatto anche l'immunoistochimica del nostro tessuto e abbiamo visto la presenza della proteina dell'adipo sulle fibre muscolari pensando di potere escludere che la produzione di adipo sia ad opera di altre cellule. Boh non capisco!
Grazie Vanessa |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2008 : 22:11:37
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quando dici "abbiamo ottenuto le cellule muscolari" intendi che le avete separate dal muscolo ed estratto immediatamente l'RNA oppure che le avete messe in coltura prima di estrarre l'RNA?
Nel secondo caso potrebbe darsi che altre cellule presenti nel muscolo siano necessarie per stimolare la produzione di adiponectina da parte dei miociti. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 00:50:05
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| Non so che linea cellulare sia la C2C12, comunque aggiungo solo che (se avete fatto colture primarie dal tessuto!) spesso linee cellulari e colture primarie esprimono proteine diverse! |
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vanessa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2008 : 15:03:26
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Da un pezzo di tessuto muscolare ho estratto L'RNA, un pezzo è stato paraffinato per l'immunoistochimica e un pezzo è stato messo in coltura per ottenere la linea primaria. Quindi potrebbe essere vero che i miotubi per produrre adipo abbiano bisogno o di altre cellule o di stimoli esterni che in coltura non hanno o non vanno bene (LPS).
Grazie
Vanessa |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2008 : 22:52:59
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Una cosa che potresti fare è fare prendere tutto il tessuto, dissociarlo e metterlo in coltura (o se possibile coltivare il tessuto intero senza dissociarlo).
Quando cambi il medium non lo buttare via, ma tienilo ed usalo come medium per le tue colture primarie di miociti. Ovviamente dovrai diluirlo con del medium fresco altrimenti le cellule non staranno benissimo.
Se si tratta di fattori secreti da altre cellule questi saranno presenti nel medium condizionato e quindi i tuoi miociti torneranno ad esprimere adiponectina.
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