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Autore Discussione  

valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 30 settembre 2005 : 09:39:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno di voi l'ha mai fatta?
Consigli?
Devo farla tutta da sola, e io ho fatto a malapena una PCR normale...
Accetto volentieri QUALSIASI suggerimento!!

(so gia' che e' praticamente impossibile che venga ai primi.. 10 tentativi.. sono preparata all'insuccesso!!)

grazie grazie

AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi
Inserito il - 30 settembre 2005 : 23:47:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Valia sono in una situazione simile per tutt'altro problema! [ke detto così potrebbe non significare molto]
ed è solo la prima settimana sigh!
non posso aiutarti ma...solidarietà!
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi
Inserito il - 01 ottobre 2005 : 05:27:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Degenerate_PCR/index.html
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valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 02 ottobre 2005 : 13:05:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille.. vi faro' sapere come va...
Alexo, che dire? in bocca al lupo anche a te! Le cose non possono che migliorare dopo la prima settimana, no?
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valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 30 dicembre 2005 : 14:42:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, ho usato i primer degenerati con diversi programmi di PCR, ho provato anche con rampe di temperatura di annealling e/o tempo di estensione. Ho ottenuto una banda piu' o meno dell'altezza voluta, ho clonato e mandato a sequenziare.. ma il frammento era stato amplificato dal solo primer reverse (in entrambe le direzioni).

Cosi' ho provato una nested PCR usando sempre primer degenerati, purificando la banda dal gel dopo la prima PCR! Ho ottenuto un'altra banda interessante.. questa amplificata da primer F e R..ma non si tratta del gene che mi interessa!

Aggiungo che sto usando 5 diversi primer reverse, altrimenti uno solo sarebbe stato troppo degenerato! Cosi' invece quello col numero maggiore di degenerazioni ne ha circa 300.

Avete consigli???
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