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Autore Discussione  

Marianna
Utente Junior




146 Messaggi
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 00:07:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi...oggi mi è capitata una cosa strana..! Ho fatto delle digestioni di preparazione x un clonaggio..quindi inserto e vettore..e quando sono andata a caricare sul gel di agarosio..tutti i non digeriti si sono normalmente depositati nei pozzetti, mentre le digestioni...TUTTE...sono state praticamente rigettate fuori..uno spill over continuo...conclusione.. quando ho guardato il gel nei suddetti pozzetti era come se nn fosse stato caricato nulla! Ki mi da un'idea x spiegare questo fenomeno strano?

Vi premetto ke le digestioni le ho purificate con l'apposito kit Quiagen e le ho lette al nanodrop, prima di caricarle sul gel..!

Attendo notizie!
Farah

valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 01:29:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse questo puo' aiutare...
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5148

Puo' essere che per qualche ragione nelle digestioni fosse rimasto dell'etanolo...
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 16:40:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo anche io.

Probabilmente durante l'estrazione da gel hai usato delle colonnine che alla fine vanno lavate con il Washing buffer che contiene alcool al 70%... non tutti kit lo dicono e non tutte le persone lo fanno, ma dopo aver fatto la centrifugazione e quindi rimosso l'alcool, si deve fare un'altra centrifuga con il tubino sotto vuoto. In questo modo si elimina dal filtro la restante quantità di alcool, poi si procede mettendo l'eluition solution per eluire il DNA dalla colonna.
Se non fai questo passaggio rimane un po' di alcool nella colonna che scenderà poi con l'eluition solution che oltre a non farti venire la digestione, caricato su gel esce fuori dal pozzetto per la dissoluzione dell'alcool in acqua.

Te ne potresti accorgere, se hai un buon olfatto, annusando la soluzione il DNA che hai usato per la digestione, se si sente o no l'alcool. Il nanodrop in questo caso non se ne accorge.

in bocca al lupo
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Marianna
Utente Junior




146 Messaggi
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 17:14:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quella dell'etanolo l'ho pensata ank'io...in effetti il passaggio sotto vuoto nn l'ho fatto...ke stupida! e pensare ke quando faccio altre cose con kit simili lo includo sempre alla fine del protocollo...! Lunedi riprovo...grazie mille!
Farah
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Marianna
Utente Junior




146 Messaggi
Inserito il - 19 febbraio 2008 : 19:49:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marianna Invia a Marianna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Era proprio quello il problema!

Meglio così!
Farah
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi
Inserito il - 24 febbraio 2008 : 00:55:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
probabilmente la causa è l etanolo...
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