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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
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 Inserito il - 20 febbraio 2008 : 19:20:25
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bisognerebbe sapere a quale tipo do insulina ricombinante ti riferisci, dato che ce ne sono diverse, come la lys-pro, l'aspart, l'insulina isofano, l'insulina zinco, la glargine, la detemir...come vedi ne esistono tantie! ognuna di queste ha un metodo di produzione diverso e, naturalmente, diverse sono le modificazioni rispetto all'ormone nativo.
in ogni caso, provo a descriverti in linea di massima la produzione di insulina ricombinante da un punto di vista generico. se non erro l'insulina è stata proprio il primo tipo di ormone ricombinante ad essere prodotto, ma non ne sono sicurissima. la strategia di clonaggio prevede la produzione delle catene A e B separatamente. la sequenza nucleotidica per la catena A viene inserita nel plasmide pBR322 (che è un vettore di clonazione per E.coli) insieme a LacZ. nel punto di fusione tra lacZ e il gene della catena A viene inserita la tripletta che codifica per la metionina.per la catena B, vengono espresse separatamente la catena N-term e quella C-terminale, separate sempre dalla tripletta della Met e sempre insieme al gene LacZ. Alla fine in pratica avrai due diversi costrutti organizzati così:
1: catena A - Met - LacZ
2: catena B N-term - Met - catena B C-term - LacZ
LacZ sarà utile per il processo di purificazione, mentre l'inserimento della Met consente poi di scindere LacZ dal resto della proteina utilizzando il bromuro di cianogeno, il quale taglia le catene a livello della Met. naturalmente, le sequenze dell'insulina non contengono nessun residuo di metionina! prodotti i peptidi, l'insulina si si struttura spontaneamente perchè la formazione dei ponti S-S raramente richiede l'uso di agenti ossidanti, di bassi pH o di ioni metallici. in alcuni casi questi si possono anche usare ma in quantità molto ben dosate affinchè si formino solo i ponti disolfuro che si devono formare.
per quanto riguarda la purificazione su colonna di maltosio, mi trovi impreparata, nel senso che non conosco questo metodo proprio per l'insulina. il principio dovrebbe essere che alla tua insulina ricombinante fai esprimere, oltre a LacZ, anche una proteina che si chiama maltose binding protein (MBP). per isolare solo l'insulina dal resto delle proteine, usi una colonna cromatografica cha ha come fase stazionaria il maltosio. In questo modo la proteina di fusione resta legata e poi la eluisci.
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insulina ricombinante
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