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biotecnologi
Nuovo Arrivato
Città: Torino
12 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2005 : 16:37:21
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Ciao a tutti. Abbiamo un problemino e speriamo che qualcuno ci venga incontro con una buona soluzione.
Stiamo cercando di mettere a punto un buon metodo di visualizzazione di un antigene citoplasmatico su cellule di una linea linfoblastoide. Abbiamo provato sia in soluzione sia fissando le cellule su vetrino con cytospin. In entrambi i casi abbiamo dovuto fissare e permeabilizzare le cellule e abbiamo dovuto utilizzare un anticorpo commerciale (è per analisi istochimiche, ma solo questo abbiamo...il bugiardino dice che è necessaria la bollitura, ma non possiamo effettuarla, e l'unico Ab esistente per questa proteina è questo. Può essere un problema?), visualizzato poi con un secondario marcato. Abbiamo provato con:
1)PFA e Triton X 100
2)PFA e saponina
3)Metanolo/Acetone
e varie combinazioni tra questi
MA
nessuno dei suddetti metodi ha portato ad un buon risultato.
Chiediamo se qualcuno conosce altri metodi di fissaggio e permeabilizzazione validi e "delicati"; l'ideale sarebbe che le cellule rimanessero integre e che il metodo permettesse di lavorare in sospensione (per poter analizzare le cellule con citoflorimetro e non al microscopio a fluorescenza...è necessaria la massima oggettività nelle analisi!)
Grazie a tutti per la disponibilità e aspettiamo risposta
G.
N.
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- B i o N i c o - |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
 Inserito il - 15 ottobre 2005 : 01:27:14
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Incollo un paio di protocolli ke abbiamo usato come esercitazione un bel pò di tempo fa,
spero possa esservi utile, io non mi ricordo + niente[memoria infame rivorrei il mio lab book!] è già tanto ke sono riuscito a recuperali!!! toh magari non vi servono a nulla, e non e neanke lontanamente quello di cui avete bisogno, ma tanto io ormai vivo solo x icolai...
enjoy:
On fixed/permeabilised cells
Plate cells on 11 or 13 or 25mm circular coverslips and grow 1-2 days
Wash 2x PBS+ (everything @RT)
15' Fix PFA 3.7% (PBS-) and wash 2x PBS-
Quench 2x 50mM NH4Cl (PBS-) 5' (not for GFPs!)
5' Permeabilize with TritonX100 0.1% in PBS-
Optional: Wash 1x PBS- and incubate 6M guanidine (or 8M in 50mM Tris)
Wash 2x PBS-
15' Block with gelatine 0.2%/PBS- and transfer coverslips on parafilm into a wet chamber
30-45' Incubate 1st antibody (40ul/13mm or 100ul/25mm) and wash 3x 5-10' with gelatine 0.2%/PBS-
30' Incubate 2nd antibody (same way) and wash 3x 5-10' as above
wash 1x with PBS-
Dip in water and mount on 2-3ul Mowiol (for 13mm)
On living cells (for plasma membrane topology)
Wash 2x PBS+ 4°C
15' Block 4°C
30' Incubate 1st antibody 4°C and wash 3x PBS+ 4°C
15' Fix PFA 4°C and wash 3x PBS- RT
From here everything @RT
10' Block
30' Incubate 2nd antibody and wash 3x PBS+ 4°C
Dip in water and mount on 2-3ul Mowiol (for 13mm)
Variation: Permeabilisation before fixation
(see C. Bucci et al, Cell, Vol. 70, 715-728, sept. 4, 1992)
Performed on BHK-21 cells plated onto 24mm coverslips
- wash 1x PBS (cold)
- incubate 5' with 0.1% saponine in 80mM K-PIPES pH6.8, 5mM EGTA, 1mM MgCl2 (on ice)
N.B.0.03% saponin is not enough; 0.5% saponin to be tried
(- optional: wash with 0.1% saponine/PBS)
- fix 15' with 4% PFA (pH 7.4)
- wash 5' with PBS
- do what you want... |
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biotecnologi
Nuovo Arrivato
Città: Torino
12 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2005 : 23:11:50
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dunque...
le metodiche, con tanto di concentrazioni, usate fino ad oggi sono:
1) PFA + saponina:
PFA 2% per il fix
e 100 microlitri PFA 4% + 1microlitro saponina (50mg/ml)+ 1microlitro glueteraldeide (12.5%)+ !° Ab
2) con acetone e metanolo:
Fix&Perm: 50%met+50%acet per 2' a -20°C
---oppure---
fix: metanolo 10' a -20°C
perm: acetone 2' a -20°C
3) PFA+ Triton:
PFA 2% 20' a 4°C
TritonX100 (0.1 %)
4) formalina e Triton:
cells fissate su vetrino con cytospin
Fix in Formalina 4% 20' a TR (alternativa a 20' a 4°C)
Perm con TritonX100 (0.1%)
"bollitura" in stufa (50°C 20' per rinaturazione antigene) in microonde non ci siam riusciti...troppo delicato il campione...
in più: i test con i metodi 1 2 e 3 son stati fatti in sospensione e anche su vetrino.
il test 1 ripetuto in sospensione e dopo colorazione, sparato su cytospin...
risultati deludenti... :(
Citazione:
On living cells (for plasma membrane topology)
Wash 2x PBS+ 4°C
15' Block 4°C
30' Incubate 1st antibody 4°C and wash 3x PBS+ 4°C
15' Fix PFA 4°C and wash 3x PBS- RT
From here everything @RT
10' Block
30' Incubate 2nd antibody and wash 3x PBS+ 4°C
Dip in water and mount on 2-3ul Mowiol (for 13mm)
questa non va bene... è per antigeni di superficie...a noi servono proteine interne... :D
altre idee?
tutti i protocolli sono poco "elastici"... |
- B i o N i c o - |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2005 : 01:03:21
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Non c'e' quealche lavoro in letteratura che descriva esperimenti simili al vostro?
Potreste usarlo come punto di partenza... |
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biotecnologi
Nuovo Arrivato
Città: Torino
12 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2005 : 15:45:57
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no...nessuno descrive altri protocolli in letteratura...
il problema è che sono cellule in sospensione...fossero cellule adese, il problema sarebbe minore...le si farebbero crescere su vetrino e il gioco è fatto...almeno in parte...
abbiam in mente di farle aderire al vetro con una soluzione di poly-L-Lisina...ma temo che con i vari passaggi le cellule adese al vetro(quelle poche che ce la faranno) si perderebbero in poco tempo.
quindi, se qualche "citologo" ci potesse fornire altre idee... |
- B i o N i c o - |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2005 : 21:44:34
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Io ho fatto qualche icc con jurkat e in effetti i risultati non sono stati dei migliori ora che ci penso...
Magari invece della polilisina puoi provare rivestimento con collagene o laminina, non so se puo' aiutare. |
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fissaggio e permeabilizzazione
Didattica e Relazioni
