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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2008 : 13:10:23
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ciao a tutti!! raga ho un problema concettuale!! aiutatemi per favore
1) si parla di estrarre le componenti di un nucleo e frazionare e purificarle, come faccio a dividere il DNA o RNA dalle proteine? e la purificazione viene condotta con l'agguita di un tag o di un epitopo al gene che esprime una detemiata proteina e poi attraverso western blot applico l'antigene specifico o l'anti.tag e trovo le proteine è corretto ?
2) come faccio a modificare un gene? cioe come faccio ad estrarre un gene da un genoma? aiutatemi vi prego
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2008 : 13:36:13
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calma. secondo me hai un po' di confusione.
allora:
1) ci sono metodi di frazionamento ed estrazione come quello con fenolo-cloroformio per gli acidi nucleici
per le proteine vedi qui: http://www.pacifici-net.it/Biologia/Metodologie_Biochimiche/purificazione_di_una_proteina.htm
se vuoi purificare una proteina con un tag, allora puoi fare una cromatografia di affinità (cerca in google). il western blot ti permette solo di vedere la proteina a cui hai fuso il tag, non di purificarla.
2) di solito si fa per PCR. puoi disegnarti due primer che annilano a monte e a valle del gene e amplifichi il tratto di dna d'interesse. se lo fai sul genomico avrai il gene completo (cioè anche con gli introni). se invece lo fai sul cDNA (cioè estrai l'rna totale, lo retrotrascrivi in cDNA e fai la PCR come ti ho detto prima, allora avrai il gene "maturo" ossia la parte codificante.
se cerchi in google basandoti sugli elementi che ti ho dato, vedrai che trovi tante cose che ti spiegano anche con schemi.
se non hai capito chiedi pure! |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2008 : 10:20:57
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| Grazie mille per l'aiuto...ho capito abbastanza bene ora !! Mi chiedo pero un'altra cosa: come faccio a estrarre un gene dal genoma conoscendo sia la posizione sia la funzione. |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6942 Messaggi |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2008 : 17:18:37
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| Scusa l'ignoranza però te mi dici di applicare una PCR, e ci sto.Quindi conoscendo la sequenza del gene per es tramite spettroscopia di massa io posso formare un primer di oligonucleotidi complementari alla sequenza del gene al quale voglio applicare la PCR.La cosa che mi sfugge è del genoma umano (che è enorme) come faccio io a trovare quel gene e applicarci la PCR sò che si puo utilizzare un clonaggio di tipo posizionale e poi correlare le mappe fische a quelle citogenetiche attraverso FISH e localizzare il sito del gene sul cromosoma che lo contiene. A tale punto che faccio ? come applico la PCR? devo utilizzare enzimi di restrizione ?La mia idea che nn so se sia esatta oppure assurda!! è che io posso attraverso ultracentrifugazione separare il nucleo di una cellula , lo posso estrarre, posso trattare con etanolo ed estrarre il DNA precipitato dalle altre componenti dell'estratto .A qst punto incubo tt l'acido nucleico estratto direttamente con oligonuceotidi(complementari al gene sequenziato) e con taq polimerasi ed infine li fraziono con elettroforesi in gel ... MA ANCORA UNA VOLTA NN SO QUALE FRAMMENTO CONTIENE IL GENE !!!! stò impazzendo..............VI PREGO AIUTATEMIIIIIIIIIIIII ...GRAZIE IN ANTICIPO |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2008 : 19:19:15
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RISPONDETEMIIIIIIIIIII
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2008 : 19:38:00
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La specificità è data dagli oligonucleotidi, per cui SAI che il frammento amplificato
dalla taq è quello che cerchi, visto che hai fatto in modo che la polimerasi
amplificasse proprio quello. Come? disegnando degli oligonucleotidi che si appaiano
unicamente alle estremità di quel gene, e da nessun'altra parte in tutto il genoma.
Con uno strumento bioinformatico com BLAST puoi ottenere quest'ultima certezza.
Nella realtà pratica si tende ad amplificare solo esoni oppure solo
l'ORF (partendo da cDNA, anzichè da DNA genomico) perchè un intero
gene è lunghetto e generalmente inutile ai fini di utilizzo funzionali. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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biologia molecolare
