| Autore |
Discussione |
|
|
cinzy
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 21 marzo 2008 : 09:01:24
|
Buongiorno,
vorrei avere informazioni sulle tecniche: DGGE e TGGE nel dettaglio.Grazie mille
|
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
|
|
markjo74
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: ercolano
6 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2008 : 15:59:55
|
DGGE TGGE sono due tecniche molto simili tra loro che vengono impiegate per la identificazione di mutazioni non note,cioè una volta individuata la mutazione in un gene questo dovrà essere clonato e sequenziato x individuare se la mutazione è una mutazione patogena o silente.La identificazione,ti ripeto,è qualitativa cioè significa che io vedo solo che effettivamente c'è una mutazione ma non so di che natura essa sia.Per saperlo devo sequenziare il gene su cui si trova e vedere quali alterazioni nella cornice di lettura dell'mRna hanno apportato.
Su cosa si basano queste tecniche:
Sono basate entrambe sulle caratteristiche chimico-fisiche del Dna,e in particolare sul punto di fusione(Melting Point) (o Tm Temperatura di melting cioè il valore di T a cui il Dna mostra il 50% del suo effetto ipercromico e quindi è per metà denaturato e per metà a doppio filamento)La Dgge(Denaturant Gradient Gel Electroforesis) si esegue ponendo sia il Dna in cui tu pensi possa esserci una mutazione sia quello normale(x confronto) su un gel di acrilammide variabile in concentrazione nn molto alta dipende da quanto è grosso il tuo Dna(in certe situazioni si può utilizzare anche agarosio).Su questo gel fai un gradiente di concentrazione crescente(esistono dei kit appositi) di urea/formammide,crescente secondo la polarità di migrazione del Dna(:quindi dal polo negativo al positivo della cella elettroforetica).Durante la corsa cosa si osserva? Che se è presente una mutazione nel tuo Dna,questa va ad alterare la composizione in basi (%GC) del Dna,causando un abbassamento o un innalzamento della Tm rispetto al Dna selvatico.Quindi se la mutazione ha comportato un abbassamento del punto di melting,occorerà una minore concentrazione di Urea/formammide x denaturare il tuo Dna,quindi all'inizio della elettroforesi il Dna mutato sarà già denaturato e io me lo ritroverò che migra più lentamente rispetto al Dna selvatico( i filamenti Dna single strand migrano più lentamente rispetto ai double strand).Se invece la mutazione ha innalzato la Tm,il Dna mutato percorrerà più strada e viaggerà più velocemente x andare a denaturarsi verso la fine del gel dove la concentrazione di Urea/formammide è più alta.E lì terminerà la sua corsa.Quindi facendo il paragone con la migrazione del Dna sevatico,che userai come riferimento,puoi trarre le tue conclusioni.
La TGGE (Temperature Gradient Gel Electroforesis) è la stessa cosa,
solo invece che usare un gradiente di Urea/formammide e quindi una denaturazione chimica del Dna,la facciamo con la temperatura,facciamo un gradiente di temperatura dalla più bassa alla più alta ma è molto più semplice a farsi la Dgge (e anche meno costosa!!).Spero di esserti stato d'aiuto.Cordiali Saluti.Marco |
 |
|
|
cinzy
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2008 : 22:12:38
|
Grazie mille per avermi chiarito le idee...volevo chiedere un'alta cosa: Navigando in rete ho trovato questa affermazione: "il gradiente di denaturazione si può ottenere utilizzando urea o formaldeide". Secondo voi è esatta?
Grazie ancora
 |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2008 : 22:52:43
|
riferito alla DGGE ho sempre sentito parlare di un gradiente denaturante di urea/formammide, sei sicura di aver letto bene?
|
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
cinzy
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2008 : 18:06:09
|
| si ho letto la stessa cosa su diversi articoli...grazie mille |
|
|
|
markjo74
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: ercolano
6 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 23:28:02
|
sì,può darsi che qualche scellerato adoperi anche la forlmaldeide
perchè ti consente di risparmiarti l'urea,ma a formaldeide è termolabile e dovresti lavorare a temperature rigorosamente costanti.Usando urea e formammide vai sul sicuro,tranquilla!
|
|
|
| |
Discussione |
|
DGGE,TGGE
Didattica e Relazioni
