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vesania
Nuovo Arrivato
Cittā: rovigo-ferrara-rovigo
98 Messaggi |
 Inserito il - 27 marzo 2008 : 11:49:24
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dopo trasfezione in cell eucariotiche di un vettore virale per l'espressione di proteine eucariotiche, il gene targhet che codifica per una data proteina č fusa all' NH2 terminale con la porzione aminotermiale di un'altra proteina propria della cell che targhetta la proteina prodotta successivamente ad un dato compartimento, esempio citosol. dopo aver lisato le cellule il professore ha spiegato che la purificazione puō avvenire tramite nichel oppure le proteine di interessere posso essere fuse a istidine.
chi mi spiega questi due concetti che nel mio libro non trovo niente a riguardo.
grazie mille
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
 Inserito il - 27 marzo 2008 : 13:06:00
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ciao,
il concetto č abbastanza semplice. Per poter ottenere una soluzione in cui ci sia solo la tua proteina č necessario eseguire una purificazione, cioč isolare la tua proteina da tutte le altre che ci sono nella cellula.
Per fare questo le tecniche sono molte e una di queste č quella di inserire una coda di istidine alla tua proteina. Questo lo si fā quando si progetta il costrutto plasmidico, cioč al alla fine della sequenza ci metti tante triplette che codificano per istidina quante istidine vuoi nella coda della tua proteina.
I lisato cellulare, cioč la soluzione che ottieni dopo una sonicazione ad esempio, dopo centrifugazione, viene fatto passare in una colonna cromatografica, la cui matrice in questo caso č impaccata con il nikel che andrā a legare la coda di istidina della tua proteina.
La tua proteina resta inizialmente legata alla colonne e potrai quindi fare passare le altre che non ti interessano. Poi eluisci (fai staccare) la tua proteina mettendo nella colonna una certa concentrazione di imidazolo, che si lega in modo competitivo.
ciao |
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lā
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 23:38:09
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| ciao! per purificare una proteina con la coda di istidina dovrai far passare il tuo lisato all'interno di una colonna che sarā complessata con il nichel. In pratica funziona cosi': la matrice della resina che si trova nella colonna č associata all'acido nitroacetico, che si lega a 4 dei 6 legami dello ione nichel. Restano quindi 2 legami liberi per il legame alle istidine della tua proteina. Per staccarla usi un tampone con una elevata concentrazione di Imidazolo, che va a competere con la proteina per il legame alla colonna, staccandola quindi. |
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lā
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 23:39:26
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| scusa RNA world non avevo visto la tua risposta! |
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lā
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2008 : 23:41:27
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| scusa RNA world non avevo visto la tua risposta! |
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Discussione |
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proteine fusione / purificazione con istidine e Ni
Didattica
