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doctor82
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2008 : 19:33:41
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ciao amici avrei una domanda. ho svolto uno studio sull'espressione di alcuni geni mediante PCR Real Time. i risultati sono espressi in delta CT (Cycle Threshold). Mi chiedevo esiste un modo per convertire i risultati da CT in numero di basi, e se si quali sono?(formule o programmi informatici)?
la seconda domanda è questa: se l'espressione di un gene marker è uguale per esempio a 10 ct in un paziente malato e 20 ct in un soggetto sano, questo significa che il gene è iperespresso nel soggetto malato?è sempre vero?
ultima domanda: una volta ottenuto i dati in CT io ho valutato l'espressione relativa del gene in funzione di un gene endogeno utilizzando la formula 2 elevato alla -delta delta ct...posso io svolgere uno studio statistico solamente sui valori "grezzi" espressi in Ct o non è possibile fare questo poiche i valori hanno un senso solo se riferiti ad un gene di riferimento?
grazie per l'aiuto e spero di essere stato chiaro :)
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2008 : 19:45:18
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Citazione:
Messaggio inserito da doctor82
ciao amici avrei una domanda. ho svolto uno studio sull'espressione di alcuni geni mediante PCR Real Time. i risultati sono espressi in delta CT (Cycle Threshold). Mi chiedevo esiste un modo per convertire i risultati da CT in numero di basi, e se si quali sono?(formule o programmi informatici)?
questa scusa ma non l'ho capita...
- il numero di paia di basi è la lunghezza del frammento che amplifichi
- il CT ti dice "quanto è espresso il gene"
... non vedo nessuna relazione tra le due cose
ma forse non ho capito la domanda!
Citazione:
la seconda domanda è questa: se l'espressione di un gene marker è uguale per esempio a 10 ct in un paziente malato e 20 ct in un soggetto sano, questo significa che il gene è iperespresso nel soggetto malato?è sempre vero?
In realtà ti sei risposto da solo sotto!
No non puoi dire che è vero in assoluto! Devi fare la normalizzazione rispetto a 1 gene "housekeeping" (tra l'altro in realtà uno non basta... in molti lavori ormai si utilizzano più geni "housekeeping" e bisognerebbe anche valutare che i geni utilizzati siano veramente "housekeeping" cioè non varino nelle varie condizioni... io ad es. ne utilizzo 3, dopo aver fatto una selezione e confermato che siano stabili!)
Citazione:
ultima domanda: una volta ottenuto i dati in CT io ho valutato l'espressione relativa del gene in funzione di un gene endogeno utilizzando la formula 2 elevato alla -delta delta ct...posso io svolgere uno studio statistico solamente sui valori "grezzi" espressi in Ct o non è possibile fare questo poiche i valori hanno un senso solo se riferiti ad un gene di riferimento?
beh la risposta è quella di prima...
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doctor82
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 11:32:24
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si GFPina in effetti sulla prima domanda mi sono espresso male quello che volevo chiedere è se vi è una relazione tra il valore di CT e il numero di copie di tradotto genico! posso in qualche modo conoscendo il ct che è una espressione dei cicli di amplificazione che io faccio ricavarmi il numero di copie di tradotto genico a cui arrivo al termine della mia amplificazione?
grazie mille spero che quello che ho scritto ora abbia più senso, perdonate ma non sono del mestiere  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 20:09:55
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Citazione:
Messaggio inserito da doctor82
posso in qualche modo conoscendo il ct che è una espressione dei cicli di amplificazione che io faccio ricavarmi il numero di copie di tradotto genico a cui arrivo al termine della mia amplificazione?
La risposta è semplicemente NO! Ma la spiegazione è un po’ più complessa!
Prima di tutto devi aver presente come è fatta una curva di amplificazione:
In teoria ad ogni ciclo di PCR si raddoppia la quantità, questo in realtà è vero fino ad un certo punto in quanto quando iniziano a scarseggiare i reagenti non hai più un andamento lineare (la curva si abbassa) e arrivi ad un plateau.
Per questo motivo non è calcolabile il “numero di copie che hai al termine della amplificazione”!
La relazione in realtà esiste ed è questa… (vale però solo finché sei nella fase lineare!):
FQ = ST (1+e)^(n-1)
FQ = final quantity
ST = starting quantity
e = efficienza della amplificazione (va da 0 a 1)
n = numero di cicli
nella formula è compresa anche l’efficienza perché se questa non è del 100% non avrai il raddoppio del templato ma meno!
Quello che devi sapere però è la quantità iniziale, se non la sai non puoi comunque calcolare la quantità finale.
La real-time serve per quantificare, ma quello che quantifichi è la quantità iniziale, non quella finale. Per fare questo le curve di PCR vengono analizzate nella fase “lineare” in cui è vera la relazione che ad ogni ciclo hai il doppio di quantità. (fermo restando quello detto prima sulla efficienza però).
Il CT è solo un valore “arbitrario”, tu decidi dove impostare la soglia! L’unica cosa che puoi dire è che poni la soglia uguale per tutti i tuoi campioni e quindi puoi compararli!
A questo punto la quantificazione che fai può essere di due tipi:
Quantificazione Relativa: questo è il caso in cui utilizzi un housekeeping
- normalizzi tutti i risultati rispetto all’housekeeping
- poi il rapporto tra trascritto e housekeeping uguale a 1 per un determinato campione (che sarà il tuo “campione di riferimento”)
ad es. hai campioni con vari trattamenti e un controllo non trattato, poni questo “controllo” come 1 e vedi con i vari trattamenti se hai aumento o diminuzione del tuo trascritto e di quanto rispetto al controllo.
Quantificazione Assoluta: in questo caso utilizzi uno standard a “concentrazione nota”
Lo standard deve essere quantificato prima della PCR utilizzando metodi spettrofotometrici o fluorimetrici.
Utilizzi poi varie diluizioni di questo standard in questo modo puoi costruirti una curva standard che metta in relazione il ct con la quantità di DNA (non sto a dilungarmi perché se cerchi troverai tante discussioni in proposito e una bella spiegazione di chick80 ).
In questo caso puoi quindi ricavare la quantità (che però ricorda è sempre la quantità iniziale) dei tuoi campioni estrapolando i valori dalla curva standard.
A questo punto conosci la quantità iniziale e… se proprio vuoi puoi applicare la formula precedente per calcolare la quantità finale… ma rimangono valide le limitazioni che ti ho detto prima!
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doctor82
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 21:14:26
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| grazie GFPina sei stata illuminante...approfitto della tua e della vostra pazienza per chiedere ancora qualcosa. io come avrai capito nel mio studio ho valutato l'espressione relativa dei geni in riferimento ad un controllo. ora vi chiedo ha comunque senso svolgere uno studio statistico sui risultati in ct dei miei geni studiati prima che utilizzi i valori dei ct per calcolarmi con la formula 2 elevato alla -delta delta ct l'espressione relativa? sui dati "grezzi" espressi in ct posso svolgere uno test t di student o costruirmi roc curve? può avere un senso o è solo tempo sprecato? per favore se non sono stato chiaro ditemelo |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2008 : 19:39:49
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Secondo me non ha molto senso... i dati grezzi (non normalizzati!) non mi sembrano un buon punto di partenza per un'analisi statistica... ma visto che a me solo la parola "statistica" fa venire l'orticaria aspetto anche altri pareri in proposito!
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LorenZ
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95 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2010 : 20:12:31
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Spero qualcuno possa chiare questo dubbio atroce che non riesco a togliermi... la Ct, sui miei appunti, viene definita come il "numero di cicli di pcr necessari a raggiungere un livello dato di fluorescenza"... perciò se io dico che ho una ct per gene 1 di 22 ed una ct di 15 per gene 2, vuol dire che ( fissata una data fluorescenza... che ho deciso io arbitrariamente ) il gene 1 avrà impiegato 22 cicli, mentre il gene 2 ne avrà impiegati 15 per raggiungere la fluorescenza scelta ( da me ) ?
E' per questo che la Ct viene definito un valore scelto arbitrariamente?
Scusate se la domanda può sembrare ovvia... ma se c'è qualcuno che la fa tanto ovvia non è |
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LorenZ
Nuovo Arrivato
95 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 19:39:51
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Non c'è nessuno che può rispondermi? 
Eppure credevo che la domanda fosse semplice  |
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LorenZ
Nuovo Arrivato
95 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2010 : 15:35:00
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Oggi, dopo l'esame e dopo che mi è stata fatta la domanda che sovra avevo posto, posso dire che la risposta che mi ero dato era corretta 
Mi rimane comunque oscuro come mai, ad una domanda così semplice, nessuno abbia trovato un secondo per dirmi se quello che dicevo era corretto o meno  |
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conversione da Cycle Threshold in paia di basi
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