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87sara87
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
5 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2008 : 15:39:31
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Ciao a tutti mi sono appena registrata però ho visitato il forum velocemente prima e trovo ci siano tantissimi studenti e non davvero preparati 
Sono una studentessa di milano e sono iscritta al secondo anno di biotecnologie. Avrei una domanda in relazione ad all'esame di laboratorio biochimico cellulare che devo preparare.
Qualcuno mi può spiegare il saggio della b-galattosidasi come verifica dell'efficienza di trasfezione?
grazie mille in anticipo 
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Sara |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 16:32:01
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ciao sara e benvenuta, credo che ti riferisca alla b-gal come gene reporter. se ne parlava quì ed anche quì
vedi se possono esserti utili.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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87sara87
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
5 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 19:15:31
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t ringrazio per l'aiuto davvero, ma a me interessava in particolare l'azione della b-galattosidasi in relazione all'X-gal e al substrato ONPG. Io ho trovato la spiegazione in inglese:
"The natural function of b-galactosidase is to cleave galactopyranosides into glucose and galactose. It also cleaves artifical substrates such as X-gal to create an insoluble bright blue product.
Quantitative : b-gal can be used for hydrolysis of the artifical substrate ONPG. this creates a yellow product that can be measured spectrophotometrically.
Histochemical stains: if cells that express b-gal are exposed to the artificial substrate X-gal, it is cleaved to an insoluble blue product that is visible within the cell. this identifies any cells that express b-gal. used to measure the % of cells that are transfected."
Ora la traduzione del passaggio me la sono scritta solo che non riesko a collegare le informazioni che ho e nn c stò capendo davvero nulla in merito!
aiutooooooooooooo |
Sara |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 21:27:29
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beh, io non so quali siano le informazioni che hai tu, comunque dalla spiegazione che hai trovato credo che si capisca abbastanza bene, nel senso che se tu fai una trasfezione usando come gene reporter (il cui significato è spiegato in uno dei link)la beta-gal, puoi vedere quantitativamente le cellule che sono state trasfettate in modo efficiente. cioè, hai le tue cellule, le hai trasfettate, fornisci il substrato ONPG e, laddove c'è stata trasfezione la beta-gal idrolizza l'ONPG e si forma un prodotto giallo. l'analisi spettrofotometrica ti fornisce un risultato quantitativo sulla % di cellule che hanno incorporato il gene.
per quanto invece riguarda l'analisi istochimica, fornisci il substrato x-gal che è clivato dalla beta-gal formando un prodotto blu insolubile che si localizza all'interno della cellula. anche quì, puoi fare un'analisi quantitativa.
cosa dicono i tuoi appunti invece?
il test dell'ONPG però non viene usato solo per monitorare la trasfezione con gene reporter beta-gal, ma :
"The test is important in differentiating the Enterobacteriaceae which are commonly classified
according to their ability to ferment lactose. It is also used to differenciate Neisseria Lactamica from other fastidious Neisseria species.
The ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside) test is used to determine the presence or absence
of the enzyme ß-galactosidase in and organism. The presence of two enzymes, permease and ßgalactosidase are required to demonstrate lactose fermentation. True lactose non-fermenters do not possess either of these enzymes. Late lactose fermenting organisms do not have permease but do
possess ß-galactosidase, which hydrolyses lactose to form galactose and glucose. ONPG is similar in structure to lactose. If ß-galactosidase is present, the colourless ONPG is split into galactose and onitrophenol,a yellow compound"
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87sara87
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
5 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2008 : 21:37:06
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Ah ecco quindi x-gal e onpg vengono usati in alternativa l'uno all'altro in relazione alla b-gal? con x-gal le cellule trasfettate sono blu con onpg gialle....in parole molto povere è giusto km concetto? x' è proprio questo che nn riuscivo a capire dai miei appunti
grazie mille ankora |
Sara |
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Saggio b-galattosidasi
Didattica
