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simostef
Nuovo Arrivato
63 Messaggi |
 Inserito il - 03 aprile 2008 : 11:59:32
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allora, dopo aver fatto l'elettroforesi, ottengo che vicino al pozzetto ci sono i prodotti più pesanti, invece quelli più leggeri si sono spostati, mi potete spiegare meglio il marker come li riconosce?che vuol direche il merker è di 100 paia di basi e il prodotto più pesante 600(pdb)?grazie
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2008 : 12:18:33
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in generale, un marker è un marcatore di pesi molecolari. ciò significa che è formato da tanti frammenti di DNA a peso molecolare noto che migrano sul gel. i frammenti si arrestano nella corsa a seconda del pm, quindi frammenti a pm inferiore migrano più in basso. questo vale anche per i marker di proteine. quindi a te basta guardare il frammento con un pm vicino a quello della tua banda di interesse, confrontano l'altezza tra marker e campione.
guarda l'immagine:
Immagine:
2,84 KB
immagina che il frammento che stai cercando ha un pm di 3 Kb, quindi, guardando il marker vedi che hai frammenti con pm di 4.5 e 2.3 Significa che il tuo frammento, quello che ti interessa nel campione, si sarà posizionato sul gel a metà strada tra il marker di 4.5 e quello di 2.3
per la tua 2° domanda, penso che tu voglia dire che il tuo marker contiene il frammento più leggero di 100 bp, mentre quello più pesante è di 600 bp. tra 100 e 600 bp hai una serie di frammenti intermedi.
capito?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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simostef
Nuovo Arrivato
63 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2008 : 13:10:43
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ok!mettiamo che io volessi trovere il prodotto pcr più piccolo, dovrei andare a guardare i frammenti di marker più piccoli.. giusto?
ed un ultima cosa, mica sai anche cosa sono i controll positivi e negativi? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2008 : 13:57:15
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il marker ti serve solo per capire più o meno in quale posizione sul gel devi andare a cercare il tuo frammento. quindi, se trovi una banda in basso al gel, puoi vedere quali marker stanno grosso modo alla stessa altezza e capire qual è il pm della banda che hai trovato, perchè la grandezza dei frammenti marker tu la conosci (è scritta in un "foglietto illustrativo"!).
per i controlli, meglio un esempio. immagina di andare a cercare una mutazione nota su un campione di DNA di un paziente. ora, a te serve un controllo positivo (cioè, un campione di DNA dove sai per certo che c'è la mutazione) e un controllo negativo (cioè un campione di DNA dove sai per certo che NON c'è una mutazione). è una mutazione nota, amplifichiamo tutti e tre i campioni: quello da testare, il ctrl positivo e quello negativo. se se stata brava, cosa ti aspetti da questa amplificazione? che il tuo ctrl positivo si amplifichi (la mutazione c'è e tu lo sapevi), che il tuo ctrl negativo NON si amplifichi (la mutazione NON c'è) e che il tuo campione da saggiare si amplifichi o meno a seconda che ci sia o no la mutazione che cerchi. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2008 : 19:12:57
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| Aggiungo solo che il controllo negativo può anche essere un controllo di contaminazione, cioè una PCR in cui metti tutti i reagenti tranne il campione e ovviamente non devi vedere alcuna banda! (è consigliabile aggiungere sempre questo tipo di controllo quando si fanno delle PCR!) |
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simostef
Nuovo Arrivato
63 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 09:11:10
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grazie iside e grazie gfpina, mi hai preceduto, stavo per chiedere riguardo alle contaminazioni!
me ora, già che mi trovo, vi chiedo ma avete idea di cosa sia la pcr- ibridazione inversa? su internet non riesco a trovare nulla! |
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2008 : 15:27:11
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concordo con gfpina e aggiungo che il controllo positivo (importante come il negativo) permette di capire se l'amplificato ottenuto è corretto e a quale banda del marker co-migra. ciao! per la ibridazione inversa prova a guardare questo link....didattica.cribi.unipd.it/ingegenet/21Lucidi4x.pdf
ciao |
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ilarip
Utente Junior
Prov.: Bologna
Città: Bologna
432 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2008 : 15:43:00
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ciaooooo
visto che si sta parlando di controlli positivi e controlli negativi ne approffitto per fare un altra domanda
I 2 controlli vanno fatti ogni qual volta si tratta un campione con la PCR??? o vanno fatti dopo aver ottenuto un numero di campioni???
visto che forse nn sono stata molto chiara mi spiego meglio:
Ad esercitazione avevamo a che fare con 4 campioni di dna dove si voleva andare a cercare la presenza o meno di una delezione, oltre a questi campioni ce ne hanno dati altri 2 che sarebbero 1 il controllo positivo e l'altro il controllo negativo.....la professoressa a questo punto ha detto che solitamente il controllo negativo si effettua solo dopo aver ottenuto almeno 10 campioni.. quindi a mio avviso è in contraddizione con quello che abbiamo fatto noi (visto che di campioni ne avevamo 4)
sono davero superconfusionata
mi aiutate a capirci qualcosa
Grazie mille
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Ho imparato.. .che le opportunità non vanno mai perse.
Quelle che lasci andare tu...le prende qualcun altro
Ho imparato...che è meglio dare consigli solo in due circostanze...
Quando sono richiesti e quando ne dipende la vita.
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2008 : 16:09:04
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| ciao ilarip! un esperimento di pcr o da dna genomico o cDNA richiede l'utilizzo di un controllo negativo sempre, questo perchè permette di escludere una possibile contaminazione dei reagenti (buffer, magnesio, primers...acqua) impiegati nella reazione stessa. generalmente non sempre si ha un problema di uesto tipo, ma non si può nemmeno escludere un nostro errore...il piu banale che puo succedere è quello di pescare da reagenti diversi con lo stesso puntale o usare un acqua (che è il nostro controllo negativo) contaminata. il controllo positivo lo faccio gneralmente all'inizio della messa a punta delle condizioni ottimali di reazione e permette il confronto delle dimensioni delle bande ottenute con "qualcosa" di cui si è certi. spero di esserti sato utile, ciao! beppe |
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ilarip
Utente Junior
Prov.: Bologna
Città: Bologna
432 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2008 : 17:00:28
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graie mille beppe
adesso ho le cose un po' più chiare
ciaooooo |
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2008 : 17:02:21
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buon pomeriggio! |
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Discussione |
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PCR..i marker!
Didattica
