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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
 Inserito il - 16 aprile 2008 : 13:56:52
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Salve!
Sono alle prese con l'allestimento della preparazione di una libreria di cDNA. Secondo il tecnico che mi segue, il quale non ha moltissime conoscenze riguardo a questo specifico esperimento, dopo l'estrazione dell'RNA con TriPure (roche) secondo il metodo tradizionale é necessario anche digerire con DNAsi l'RNA ottenuto. Questo a dispetto del fatto che nel protocollo di cui lui si fida ció non ci sia scritto e del fatto che leggendo qui sul forum ho visto che per le proprietá del Trizol (pH 5,2) il DNA non dovrebbe contaminare il mio estratto. Credete sia effettivamente necessario?
Giusto per togliermi lo sfizio poi: la mia libreria di cDNA la devo fare partendo da tessuto floreale (o al limite foglie) e utilizzerei il kit della Clontech Direct SMART cDNA Library Construction kit. Credete che qualche dei kit per estrazione di RNA da pianta vadano bene per ottenere la mia "materia prima" o devo per forza usare il Trizol? Se fosse un vantaggio economico capirei le ragioni di chi vuole farmelo fare, ma non c'é vantaggio economico e ben che meno in termini di tempo. L'unica questione é che quasto tecnico asserisce di non sapere se la qualitá del RNA da kit é paragonabile a quella della purificazione con TriPure per gli step successivi. Io non vedo perché no, ma é impossibile convincerlo a meno che qualche esperto non me lo consigli apertamente. Ed é lui quello che fa gli ordini, quindi.....
Personalmente il kit della INVITEK e l'RNeasy plant mini kit della qiagen mi sembrano piuttosto ok, almeno a livello di promesse....
Grazie
(ps. ho giá letto quasi tutti i topic simili, ma non ho trovato risposta!)
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2008 : 16:46:46
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ciao io ti suggerisco di trattarlo comunque con DNAsi... ho provato anche il trizol (ho già risposto nel topic di prima) ...e un pò di dna genomico lo vedo! ho usato l'RNA estratto come templato in una reazione di pcr e vedo la mia banda di interesse!!!!!!! beppe |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2008 : 19:57:08
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Per la prima domanda concordo con bepo, il trattamento con DNAsi è fondamentale il alcuni casi (in altri puoi farne a meno), per il tuo caso ti consiglio di farlo
Citazione:
Messaggio inserito da Ayla
... e del fatto che leggendo qui sul forum ho visto che per le proprietá del Trizol (pH 5,2) il DNA non dovrebbe contaminare il mio estratto.
Il "non dovrebbe" è esattamente un "non dovrebbe", non una certezza!
Dipende comunque da altri fattori, primo fra tutti l'operatore: se tiri su un po' di interfase ti porti dietro anche il DNA (parlando solo di "contaminazione" senza contare la discussione che ho avuto in passato su questo argomento!  )
Riguardo l'utilizzo del kit l'unica cosa che ti posso dire è che in generale la resa dovrebbe essere "leggermente" inferiore ma la purezza maggiore! Comunque i kit ormai sono ben "fatti" (non mi viene la parola giusta  ) e le rese sono buone (non ho mai lavorato su piante però!!!)
Poi tutto dipende sempre dall'utilizzo che ne devi fare!
Io ad esempio sono passata dai kit a fenolo/cloroformio perché avevo bisogno anche dei piccoli RNA che con i kit su colonnina vengono persi! |
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2008 : 10:05:07
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Grazie mille!
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DNAsi dopo estrazione TriPure (TRIZOL)
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