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silvia_biotech
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2008 : 16:40:44
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ciao a tutti ragazzi,
mi sapreste dire perchè nel southern prima della denaturazione dell'acido nucleico si va a depurinare ponendo il gel per 10 min in HCl? Ok, serve per garantire un trasferimento + veloce dei frammenti dal gel al filtro, ma in questo modo non si preclude l'ibridazione con la sonda? se vengono eliminate le purine non si inficia il corretto appaiamento?
grazie a tutti!
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2008 : 18:13:07
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HCl 0.25M per 7-8minuti causa la depurinazione del Dna e cioè DI TANTO IN TANTO elimina una purina e quindi non è che tuttti i siti vengano depurinati ma solo in alcuni siti si rompe il legame N-glicosidico tra purina e zucchero.Questo trattamento viene effettuato per poco tempo altrimenti se l'HCl venisse lasciato agire per troppo tempo depurinerebbe tutta la molecola del Dna.Il successivo trattamento con NaOh 0.4N per 30minuti porta poi alla denaturazione e quindi alla separazione dei due filamenti del duplex.
Con questi due trattamenti si determina la frammentazione della molecola del Dna(frammenti che sono a singolo filamento e che quindi poi potranno ibridare con la sonda a formare il duplex) e quindi la produzione di frammenti più piccoli che hanno un basso PM e che riescono a trasferirsi per semplice capillarità anche con il solo flusso che si genera per far passare le molecole sulla membrana.Infatti per le molecole ad alto PM non basterebbe solo questo flusso e grazie proprio a questi step il frammento viene frantumato in piccoli frammenti.
La depurinazione del Dna non inficia la successiva ibridazionne con la sonda perchè alla fine viene eseguita una blanda depurinazione della molecola del DNA,non è che vengono eliminate proprio tutte le purine,ma soltanto alcune in alcuni siti a caso.
Inoltre,le purine sempre a caso mancheranno in alcuni frammenti che si generano e quindi questo non costituisce poi un grosso problema per la successiva ibridazione con la sonda  |
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silvia_biotech
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2008 : 20:08:28
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| grazie, mi sei stata davvero di grande aiuto! ottima spiegazione, chiara e dettagliata. |
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2008 : 23:24:51
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Citazione:
Mi scuso con i moderatori ma non so in che altro modo creare un collegamento per una discussione già presente su questo forum
No problem SerenaS, se vuoi inserire un link ad una vecchia conversazione basta che la apri in un'altra finestra e poi ne copi l'indirizzo. Dovrebbe essere qualcosa tipo
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=xxxx
Dove xxxx è un numero che identifica la discussione.
A volte ci possono essere altre cose dopo TOPIC_ID (che possono o meno essere necessarie, ma non entro nei particolari), comunque nel dubbio tu copia tutto!
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SerenaS
Utente Junior
211 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2008 : 23:58:39
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| Ok!Grazie! |
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