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marcocatucci
Nuovo Arrivato


Prov.: Estero
Cittā: Leeds, England


19 Messaggi
Inserito il - 23 novembre 2005 : 22:19:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marcocatucci  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di marcocatucci Invia a marcocatucci un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve!
Sto lavorando su delle biopsie umane di intestino tenue. Mi interessa in particolare analizzare l'espressione di NOD2. Ho fatto una RealTime-PCR utilizzando il gene ABL come controllo endogeno. Adesso pero' vorrei provare un'ulteriore analisi sempre sulle biopsie, analizzando in particolare l'espressione di NOD2 da parte delle cellule epiteliali. Il problema e' che le biopsie sono cosi' piccole che non permettono la separazione delle cellule epiteliali dal connettivo e quindi non posso ottenere un estratto di RNA solo da quel tipo cellulare. Mi hanno percio' consigliato di fare una RealTime-PCR utilizzando come controllo endogeno un gene espresso solo nell'epitelio. Il valore di espressione cosi' ottenuto dovrebbe riflettere esclusivamente l'espressione da parte delle cellule epiteliali.
Mi sapreste dire se questo metodo e' affidabile?
Non ho trovato nessun protocollo riguardo questo tipo di tecnica,
voi mi sapreste indicare dove trovarlo?
Grazie infinite per la vostra disponibilita'.
Marco

chick80
Moderatore

DNA

Cittā: Edinburgh


11491 Messaggi
Inserito il - 24 novembre 2005 : 02:39:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premessa: non ho la piu' pallida idea di dove sia espresso NOD2 quindi faccio 2 ipotesi.

1) NOD2 e' espresso dal connettivo e dalle cellule epiteliali
In questo caso usando i primer per NOD2 non avrai modo di distinguere da dove proviene, non importa che standard interno usi

2) Solo l'epitelio esprime NOD2
In questo caso e' giusto usare un gene epitelio-specifico come std interno. L'unico accorgimento da prendere e' controllare che l'espressione di questo gene sia costante tra i vari campioni (es. se alcuni campioni sono stati trattati con una certa sostanza assicurati che questa non abbia alcun effetto sull'espressione del tuo std)

Per il protocollo prova a guardare qui: http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Real-Time_PCR/index.html
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Cittā: Padova


558 Messaggi
Inserito il - 24 novembre 2005 : 12:10:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
hai pensato alla microdissezione laser per riuscire ad avere solo le cellule che ti interessano?
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marcocatucci
Nuovo Arrivato


Prov.: Estero
Cittā: Leeds, England


19 Messaggi
Inserito il - 24 novembre 2005 : 12:13:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marcocatucci  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di marcocatucci Invia a marcocatucci un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie innanzitutto per la tua risposta.
NOD2 e' espresso nelle cellule epiteliali e dai monociti presenti nel connettivo; per questo motivo nel mio estratto di RNA ci sara' sia il NOD2 prodotto dall'epitelio che quello prodotto dai monociti. Mi hanno consigliato di provare una separazione dei due tipi cellulari su gradiente di saccarosio. Dovro' vedere se funziona anche con le mie minuscole biopsie.
Marco
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marcocatucci
Nuovo Arrivato


Prov.: Estero
Cittā: Leeds, England


19 Messaggi
Inserito il - 24 novembre 2005 : 12:25:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marcocatucci  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di marcocatucci Invia a marcocatucci un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si,la "laser capture" e' la prima cosa cosa a cui ho pensato. Qualcuno qui nel mio lab l'ha utilizzata, ma mi dicono che il procedimento e' abbastanza lungo e difficoltoso; credo di non avere abbastanza tempo, dato che finisco il mio tirocinio a giugno.
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