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aitan3
Nuovo Arrivato

Prov.: Napoli

71 Messaggi

Inserito il - 24 maggio 2008 : 00:11:27

Cari ho provato ad amplificare due volte (con due diverse coppie di primers) mediante real time una regione di un primo gene. Purtroppo entrambe le volte sia l'RT- che il bianco PCR (dove viene pipettata acqua e non cDNA) sono risultate contaminate. La cosa strana è che contemporaneamente all'amplificazione di questa regione genomica ho amplificato altre due regioni di altri due geni diversi che si sono amplificati piuttosto bene senza essere risultati contaminati. Tutte e tre le regioni sono state amplificate utilizzando la stessa master mix, stessa acqua e stesso cDNA di partenza.
cosa posso fare secondo voi per eliminare la contaminazione dell'amplificazione del primo gene?
Notate che ho gia cambiato una volta i primers ed entrambe le coppie di primrs utilizzate si appaiano in due esoni separati da un introne di 1 kb.
Grazie mille a chi risponderà.

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 24 maggio 2008 : 02:09:11

Ma le curve di melting come sono?
Hai lo stesso picco che ottieni negli amplificati o un picco a T inferiore che può essere dovuto ai dimeri di primers?

aitan3
Nuovo Arrivato

Prov.: Napoli

71 Messaggi

Inserito il - 24 maggio 2008 : 17:12:37

Cara GFPina purtroppo la T di melting dell'amplificato presente nel RT- e bianco PCR è la stessa.
grazie per esserti interessata.

bepo
Nuovo Arrivato

Città: novara

30 Messaggi

Inserito il - 25 maggio 2008 : 13:32:17

ciao ma a quali ct trovi il segnale nel controllo negativo? "esce" dopo il tuo gene di interese?se la contaminazione la vedi solo nel primo gene e non negli altri due, pur usando stsssa acqua e cdna e master mix, non è che è contaminata la tua sonda?oppure esistono sonde che comunque tendono a "uscire" nei tuoi campioni c-. e dis olito tendo ad uscire tardi..e aumentand il numero dei cicli non ce ne si accoreg nemmeno. ciao! beppe

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 25 maggio 2008 : 16:00:20

Citazione:
Messaggio inserito da bepo

non è che è contaminata la tua sonda?

Non credo che stia utilizzando una sonda, ma SYBRGreen visto che abbiamo parlato di T melting!

@aitan3: hai controllato con un blast che i tuoi primers non si leghino anche a qualche cos'altro?
Hai provato a seminare anche su gel e vedere che bande ti escono?
Un modo per rendere più specifico l'amplificato sarebbe appunto quello di utilizzare anche una sonda!