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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2005 : 15:32:39
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Vorrei capire bene alcune cose riguardo questa tecnica, in particolare come si leggono i grafici in scala logaritmica che si ottengono.
Credo di aver capito che si possono costruire vari tipi di grafici: fs/ss, dot-blot e un terzo tipo nel quale sulle ordinate di pone il fluorocromo e sulle ascisse un valore che non ho ben identificato!
Qualcuno può aiutarmi?
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2005 : 23:54:27
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Tiro fuori un altro problema legato al citofluorimetro:
Volendo distinguere, grazie a questo strumento, cellule dendritiche mature da immature sfruttando i co-recettori CD80, CD83, CD86, CD40, CD14, diversamente espressi nei due tipi di cellule, come dovrei agire in un ipotetico protocollo? |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2005 : 05:25:23
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Provo un po' a spiegarti quello che mi ricordo.
Quando fai passare le tue cellule nel citofluorimetro hai un laser che viene "sparato" sulla camera dove passano le cellule.
Ora, puoi raccogliere il segnale che passa attraverso la cellula (forward scatter) mettendo un rilevatore opposto al laser, o quello che viene diffratto lateralmente (side scatter) mettendo un rilevatore a 90 gradi
Visto dall'alto sarebbe qualcosa tipo (O e' la cellula):
____
Laser -------|-O--|--- Rilev. fs
|_|__|
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Rilev. ss
In generale il fs ti da un'idea delle dimensioni della cellula, mentre il side scatter della "granulosita'" superficiale e interna della cellula.
Il fs e il ss quindi cambieranno a seconda della cellula. Quindi ad es. un monocita avra' in media un certo valore di fs e un certo valore di ss, mentre un granulocita avra' un'altra coppia caratteristica. Le coppie fs/ss dipenderanno dal tipo di cellula, perche' ad es. il granulocita ha tutti i granuli all'interno che diffrangono la luce in modo diverso dal nucleo di un linfocita.
I risultati del citofluorimetro possono essere rappresentati in vari modi:
1) grafici lineari o logaritmici in cui hai su y il numero di conte e su x il parametro che ti interessa studiare (o il suo log), ad es. la fluorescenza o il contenuto in DNA della cellula ottenuto usando EtBr e valutandone l'emissione.
Se ad es. hai 2 popolazioni di cellule che esprimono l'antigene X in modo diverso e usi un anticorpo anti X coniugato ad un fluoroforo, vedrai un grafico con 2 picchi tipo questo:
conte
^ /\
| / \
| / \
| /\ / \
|/ \----/ \
|--------------------> log fluorescenza
In questo caso potrai dire che hai tante cellule della popolazione che esprime molto X e poche dell'altra. Se poi calcoli l'area sotto i 2 picchi potrai sapere anche le % giuste dei 2 gruppi.
2) grafici Dot-Plot (dot-blot e' un'altra cosa...) che usi x valutare 2 parametri insieme. In questo caso hai ad es. forward scatter vs side scatter e metti un punto x ogni cellula che hai analizzato.
Quindi se vai a contare il numero di punti in una certa area puoi sapere quante cellule del tipo che cade in quell'area del grafico c'erano nella tua soluzione.
Se usi ad es. 2 anticorpi (es. anti-CD4 e anti-CD8) coniugati con 2 fluorofori diversi puoi misurare la fluorescenza dei 2 anticorpi e mettere i risultati in un grafico CD4/CD8. In questo caso avrai:
CD8
^
| A D
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| B C
|-----------------> CD4
I linfociti CD4+ cadranno nell'area C (perche' avranno legato solo l'anti-CD4)
I linfociti CD8+ nell'area A (perche' avranno solo anti-CD8)
I doppi negativi in B e i doppi positivi in D.
Conta che puoi anche mettere piu di 2 anticorpi, ma in generale e' difficile che la macchina ti legga piu' di 4 fluorofori, e gia' con 3 avrai diversi problemi di interferenza (per lo meno, e' quello che accade con la real-time, pero penso che i problemi siano gli stessi).
PS: ma quanto sono bravo con l'ASCII art?  |
Sei un nuovo arrivato?
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2005 : 14:00:37
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GRAZIE!!!
Non puoi immaginare quante persone hai fatto felice con quello che hai scritto! |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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CIA
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Rivadolmo
233 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2005 : 14:23:01
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Infatti.... |
CIA
Se è verde o si muove, è biologia. Se puzza, è chimica. Se non funziona, è fisica.
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AntonioG
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 13:17:54
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Salve a tutti. Sono nuovo e avrei un quesito da porvi:
perchè il Forward Scatter viene rilevato a 0° e lo scatter laterale a 90° e non ad un altro angolo qualsiasi? ad esempio a 45° o a 60° etc?
So che ha a che fare con il concetto di scatter, ce ne sono di diversi tipi Rayleigh, Mye etc...ma non ho capito perchè vanno rilevate proprio in quegli angoli e non a 360°.
Grazie |
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aarieel
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 03 febbraio 2010 : 20:21:46
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ragazzi sempre riguardo la citometria di flusso qualcuno di voi saprebbe spiegarmi semplicemente cosa è? ma sopratutto viene usata x separare cromosomi?
Sto studiando come si preparano le sonde nella fish e non ci sto capendo molto |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 19:34:14
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Buonasera
lunedì il mio capo vuole che iniziamo a usare il citofluorimetro per vedere delle cellule se sono positive o meno ad un anticorpo e l'unica cosa che abbiamo è un libro sulla citofluorimetria dove non si capisce niente.
Voi avete qualche protocollo?
Quante cellule devono essere marcate?
Che differenza si ha al citofluorimetro se marcate dirette o indirette? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 19:53:08
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Citazione:
lunedì il mio capo vuole che iniziamo a usare il citofluorimetro per vedere delle cellule se sono positive o meno ad un anticorpo e l'unica cosa che abbiamo è un libro sulla citofluorimetria dove non si capisce niente.
Voi avete qualche protocollo?
Quante cellule devono essere marcate?
Che differenza si ha al citofluorimetro se marcate dirette o indirette?
Ciao,
io credo che la cosa migliore da fare, in questi casi, sia leggere
il datasheet dell'anticorpo: in ogni caso la quantità assoluta di
cellule non è determinante, almeno non quanto lo è l'espressione
del determinante di superficie che vuoi marcare.
Che cellule sono? hai un controllo negativo? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 21:59:02
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| Dobbiamo controllare se un plasmide che gli inseriamo noi viene espresso, abbiamo il controllo negativo. |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 22:30:48
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| si ma quindi dovete andare a vedere una proteina in membrana? O intracito/intranucleo? E un citometro sapete da che parte accenderlo? dico per capire se bisogna dare giusto un'indicazione o un protocollo dettagliato |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 10:44:03
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| No No serve un bel protocollo dettagliato |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 13:22:56
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vabbè ma ancora non sappiamo se è una proteina di membrana o no..se è di membrana e devi solo vedere se c'è o no fai 2 tubi, un negativo col controllo isotipico e uno col tuo Ab diretto contro la tua proteina, coniugato al fluorocromo se l'avete (marcatura diretta) o incubando poi anche con un generico gamma anti-mouse FITC PE ecc(o anti animale in cui è prodotto il tuo Ab primario), se non avete l'Ab coniugato. Io metto sempre anche la 7AAD per fare un gate sulle cellule vive (cioè le 7AAD negative) e da lì sul morfologico (FSC vs SSC). Una cosa ancora piu fine è adoperare l'Hoechst per escludere i detriti ma non so se avete un citometro che vi permetta di farlo. Fatto questo metti sotto il tubo del negativo per vedere il livello di autofluorescenza delle cellule e poi il tubo marcato per vedere, ponendo il gate sopra il negativo, quant'è la percentuale di positività..
Se è intracellulare il discorso cambia bisogna permeabilizzare con saponina o triton a seconda dell'Ab. In genere si fissano le cells in para 1% 15' si lava si fa la marcatura extracellulare 20' si lava e si risospendono le cells in 100 ul di saponina/triton, effettuando contemporaneamente la marcatura intracellulare. Questo tendenzialmente 30' a 4°C ma ripeto dipende dall'Ab, dovete vedere il datasheet. Dopo si lava e si acquisisce allo stesso modo
Ovviamente nel secondo caso la 7AAD va messa PRIMA di permeabilizzare sennò tutte le cellule sono positive! |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 13:44:19
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Credo che dobbiamo valutare l'espressione della miosina non muscolare. Quindi per usare il citofluorimetro basta schiacciare un pulsante?
E' difficile interpretare i dati? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 15:47:03
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No non basta schiacciare un pulsante.  Mi sa che a partire da zero a far marcature intracitoplasmatiche vi trovate male. Se non sapete nemmeno cosa sia la compensazione delle fluorescenze non so se riesco ad esserti utile tramite un forum..se avete modo forse vi conviene fare un IF o un WB
Comunque se devi solo vedere se la tua popolazione esprime si o no non è difficile interpretare il dato, a grandi linee col marker sul negativo tutto quello che è sopra il marker è positivo, ma ci sono delle questioni tecniche che devono essere note all'operatore. Per farti un esempio pratico, dato che la 7AAD emette nel far-red (> 650 nm) se il tuo Ab anti miosina è coniugato PE o APC o se il segnale è poco o molto intenso per la macchina le cose cambiano..perchè quando hai due o più emissioni di fluorescenza il tuo segnale può venir falsato per l'overlap degli spettri di emissione dei fluorocromi. Più colori hai nel tubo più questo diventa complicato, ovviamente la tecnologia si è evoluta quindi ci sono macchine che possono vedere fino a 7 colori contemporaneamente e che permettono di effettuare quella che si chiama "compensazione" (http://biology.berkeley.edu/crl/compensation.html) anche dopo l'acquisizione, altre no.. e se l'acquisizione è scompensata il risultato non è attendibile, perchè magari vedi una positività del tuo Ab-PE che in realtà è dovuta all'eccessiva emissione del tuo Ab-FITC. |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 16:31:47
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A me serve capire in pratica come si usa quella dannata macchina, io ho i miei campioni gia pronti e marcati con il mio anticorpo sia diretto che indiretto con relativi controlli.
Vado al citofluorimetro e cosa faccio? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 16:50:38
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Non so nemmeno se avete un Calibur un Canto o che strumento, comunque ci provo..fossi io
Lo accendo
Aspetto si scaldino i laser e intanto mi preparo il foglio di acquisizione-analisi: dot plot PerCP.Cy5.5 (dove vedo la 7AAD) vs SSC per la vitalità, gate sulle vive e da qui dot plot FSC vs SSC dove faccio un altro gate sul morfologico per escludere detriti, da qui istogramma o dot plot coloreincuihaiiltuoAb vs SSC per poter vedere l'intensità del segnale. Più un dotplot in cui metto sugli assi FL3 e FL del colore dell'Ab anti miosina.
Metto il negativo faccio acquisire un pò di eventi e intanto vedo se devo abbassare i laser perchè il negativo è troppo alto.
Metto il positivo e dò un occhio veloce al campione per vedere se i laser vanno bene e se comunque è necessario compensare
Quando la compensazione è ok acquisisco 50mila eventi per il negativo e 100-150mila per il positivo (avendo le cellule)
Dopo in analisi disegno un marker sopra la nuvola (dot plot) o a destra del picco (istogramma)che viene visualizzato nel negativo e considero come positive le cellule che cadono in quella regione |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 16:54:56
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| Domanda stupida: ma non c'è un tecnico del FACS? Cioè ti permettono di usare un macchinario senza che nessuno ti abbia spiegato come fare? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 16:57:02
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| si infatti volevo arrivare li ma mi sembrava di essere poco cortese..anche se probabilmente nemmeno io son stata di grande aiuto, perchè senza vedersi davanti la macchina e smanettarci è impossibile capire come usarla, almeno per la mia esperienza |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 19:40:51
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| Si a quanto vedo è difficilissimo, il problema è che il tecnico c'è ma noi dovremmo usare una macchina nostra e questo tecnico praticamente non è molto gentile per chi va nel suo laboratorio, quindi speravo si avere il maggior numero di informazioni per chiederle il meno possibile perchè so che altrimenti crea casini |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 19:42:45
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Quindi se avete spiegazioni anche scritte su cosa fare praticamente potreste salvarmi la vita
scusatemi se vi rompo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2010 : 20:52:31
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| Ci sono dei manuali tecnici online? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2010 : 17:31:55
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Non ne ho idea io in lab ho un manuale cartaceo che però non ho praticamente mai aperto, quello che ho imparato l'ho imparato tramite un corso con uno specialist della BD e mediante la pratica..ho trovato questa guida introduttiva ma non so quanto possa esserti utile è più teoria che pratica (ovviamente) http://www.umt.edu/cehs/BD_Learning_Guide.pdf
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beppe.cib
Nuovo Arrivato
41 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2010 : 19:20:15
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| Mi potete citare qualche marca di citofluorimetro? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2010 : 20:26:56
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Le marche più rilevanti sono sicuramente la BD biosciences
e la Beckman Coulter, i cui prodotti principali sono
rispettivamente il FACScanto e il Gallios, ma ci sono anche
modelli più vecchiotti come il BD LSRII o il FACScalibur. |
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(F.W. Nietzsche)
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Citofluorimetria
Didattica e Relazioni
