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biotecnologie
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Città: Milano
11 Messaggi |
 Inserito il - 05 giugno 2008 : 17:37:27
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Ciao,
avrei una domanda...Ho in coltura cellule fibromuscolari, il problema è che dopo qualche passaggio sopra le cellule si formano degli strani depositi tipo dei granelli scuri che piano piano tendono a staccarsi. Sembra non essere una contaminazione. Quale potrebbe essere il problema?
Grazie
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2008 : 18:32:11
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Sono pezzi di cellula. Significa che stanno maluccio.
Le hai appena scongelate? se sì può essere abbastanza normale,
anche se non ho mai usato fibre muscolari, ricordo che con le
cellule di neuroblastoma mi è capitata una cosa simile. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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biotecnologie
Nuovo Arrivato
Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2008 : 20:15:55
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Invece ho visto che tendono a formarsi non subito dopo averle scongelate, ma dopo qualche giorno. Potrebbe essere dovuto per esempio alla % di CO2 (5%) dell'incubatore?
grazie |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2008 : 21:12:09
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No. Ne dubito.
Piuttosto cerca per qualche tempo di non sottoporle a stress (antibiotici)
ma solo se sei sicuro che non sia contaminazione, cioè se la cosa non va
aumentando di giorno in giorno. Fai qualche lavaggio delicato in PBS ogni
tanto e dai loro tempo di adattarsi allo scongelamento (almeno una settimana).
Dovrebbero riprendersi. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2008 : 19:44:41
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| ciao...ti posso chiedere che tipo di terreno usi e il motivo per cui le coltivi??sai...x capire un pò meglio... |
Davide* |
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biotecnologie
Nuovo Arrivato
Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2008 : 21:24:05
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| ciao...uso come terreno il DMEMF12 addizionato con antibiotici e FBS come siero...per ora sto cercando di espanderle... |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 12:18:45
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Ciao Io ho avuto un problema simile con una coltura di fibroblasti fetali... nel mio caso il problema era il taglio con tripsina:mi disentegrava le cellule... dopo un pò di tentativi ho capito ke dovevo usarla molto + diluita (0,2% diluita ulteriormente 1 a 5) mettercene di + (3 ml per una t25 e 5ml per una t75)e lasciarla pokissimo in incubazione a 37 (45 sec e comunque non + di 1 min)ed inoltre passare le celule spesso perchè altrimenti diventava difficile staccarle!
Spero di esserti stata di aiuto!
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 20:41:46
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può darsi che è come dice sia dyonisos che MaryngA e puoi quindi evitare di stressarle
troppo oppure come dice lei devi stare attento alla tripsina...una curiosità...la usi
diluita con EDTA??cmq ci ho riflettuto possono essere cellule "bucate" dalla tripsina
o anche il reticolo sarcoplasmatico disintegrato da altri enzimi che degradano la MEC (es collagenasi jaluronidasi li hai usati?)...
li hai isolati direttamente da tessuto??una curiosità perchè le metti in incubatore visto
che nel DMEMF12 c'è l'hepes??poi credo che questo sia un terreno serum-free...secondo me
dipende dalla composizione del terreno...scusa delle tante domande e critiche ma ho proposto semplici risoluzioni del tuo problema...ciao e spero risolverai xkè sono curioso.... |
Davide* |
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biotecnologie
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Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 23:07:22
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ciao!grazie MaryngA! In effetti non avevo ancora pensato che la causa potesse essere la tripsina. Uso la tripsina+EDTA...proverò a diluirla di più ed ad usarne di più per meno tempo (io ne uso 2ml per le T75 e lascio 2 min in incubatore). Ti farò sapere...ho provato veramente tutto...speriamo che questo possa risolvere i miei problemi...
Per Biotecnologo1987...si sono cellule isolate direttamente da tessuto, ma questo passaggio non è stato fatto da me. E' un terreno serum-free a cui aggiungo l'FBS (in realtà abbiamo provato anche a cambiare siero per vedere se le cellule stavano meglio...in realtà c'è stato solo un lieve miglioramento). Per l'altra domanda mi devo informare...
Grazie a tutti per i vostri consigli...vi farò sapere come stanno le mie cellule...
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biotecnologie
Nuovo Arrivato
Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2008 : 10:04:11
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Una domanda...la tripsina la diluisci con PBS?
grazie
ciao |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2008 : 13:22:02
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si diluito in PBS (sterile kiaramente)... fammi sapere come va!
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biotecnologie
Nuovo Arrivato
Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:55:57
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| ciao...purtroppo le mie cellule stanno ancora male...avete qualche altro suggerimento?...potrebbe essere il siero che uso nel terreno di crescita non adatto alle cellule? |
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 14:25:06
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| cellule necrotiche??boh...nn so più a cosa pensare... |
Davide* |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2008 : 21:05:22
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| ma da dove vengono le tue cellule? se le hai comprate ci sarà scritto da qualche parte le condizioni di coltura se invece sono di qualche paziente (o sono murine?) prova a vedere su pubmed se qualche gruppo ha fatto qualcosa di analogo e in che modo le mantengono.. |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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pistilin
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
9 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 23:00:09
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ciao,
anke io ho in coltura cellule di fibroblastoidi,e a volte ho problemi simili...e x risolverli quando scongelo le metto in piastre da 60mm...
io cmq le cresco in DMEM (high glucose) con 10%FBS e antibiotici...
subito dopo scongelamento fanno un po di fatica...ma poi vanno fin troppo bene..
cmq se vai sul sito della ATCC(se le cellule le hai comprate e nn isolate da pazienti) troverai sicuramente il data-sheet della linea e le modalita specifiche di crescita e split..
ciao |
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biotecnologie
Nuovo Arrivato
Città: Milano
11 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2008 : 20:37:06
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Ciao,
purtroppo sono cellule isolate da pazienti. Comunque piano piano, anche se non del tutto, sto risolvendo questo problema...ho capito che non devo "stressarle" troppo!
Ciao
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colture cellulari
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