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ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2008 : 16:40:24
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ciao a tutti. sono nuovo del forum e parto subito con una domandona: come posso fare a differenziare i monociti in macrofagi?
innanzitutto premetto che ho cercato qualcosa sia sul forum che su altri protocolli ma ho trovato una eterogeneità enorme di metodi...
ma partiamo dall'inizio: io devo ottenere monociti/macrofagi da un buffycoat, perciò li separo con il ficoll, prendo l'anello e li metto in fiasche da 75 cm3 ad incubare overnight con RPMI 1640 + 20% siero umano, in modo da permettere alle cellule capaci di aderire.
Qui sorge già una domanda: ma teoricamente i monociti non dovrebbero aderire giusto? se non aderiscono, l'unico modo per farli aderire è differenziarli vero?
comunque, una volta fatti aderire scarto il non adeso, lavo con PBS ed incùbo per circa 7 giorni con RPMI 1640+20% siero (ho trovato questo in un articolo) in modo da differenziare i monociti in macrofagi (cambiando terreno ogni 2-3 giorni).
Mi chiedo, c'è un modo più veloce per ottenere macrofagi? i monociti così si differenziano?
E alla fine, come faccio a staccarli dalle fiasche, visto che ho letto in giro che sono difficili da staccare?
grazie mille per le risposte.
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buckyVSfuretto
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 22:06:05
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Ciao,
io differenzio i monociti a macrofagi dopo 6 giorni di stimolazione con M-CSF; dopo aver fatto il ficoll separo, tramite biglie, i CD14+ in modo da arricchire la mia popolazione in purezza.
I monociti si attivano leggermente e quindi appena piastrati tendono ad aderire ma non come delle vere cellule in adesione.
Spero di essere stata chiara.
V |
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ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 22:58:07
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ok. grazie.
quindi le cellule che mi ritrovo adese sulla fiasca dopo O.N. di incubazione sono monociti o macrofagi? o entrambi?
nessuno sa come si differenziano con il PMA, se si può fare? |
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Ocean
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2008 : 15:20:23
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Citazione:
Messaggio inserito da ale83t
ciao a tutti. sono nuovo del forum e parto subito con una domandona: come posso fare a differenziare i monociti in macrofagi?
innanzitutto premetto che ho cercato qualcosa sia sul forum che su altri protocolli ma ho trovato una eterogeneità enorme di metodi...
ma partiamo dall'inizio: io devo ottenere monociti/macrofagi da un buffycoat, perciò li separo con il ficoll, prendo l'anello e li metto in fiasche da 75 cm3 ad incubare overnight con RPMI 1640 + 20% siero umano, in modo da permettere alle cellule capaci di aderire.
Qui sorge già una domanda: ma teoricamente i monociti non dovrebbero aderire giusto? se non aderiscono, l'unico modo per farli aderire è differenziarli vero?
comunque, una volta fatti aderire scarto il non adeso, lavo con PBS ed incùbo per circa 7 giorni con RPMI 1640+20% siero (ho trovato questo in un articolo) in modo da differenziare i monociti in macrofagi (cambiando terreno ogni 2-3 giorni).
Mi chiedo, c'è un modo più veloce per ottenere macrofagi? i monociti così si differenziano?
E alla fine, come faccio a staccarli dalle fiasche, visto che ho letto in giro che sono difficili da staccare?
grazie mille per le risposte.
Io su una linea di monociti ottenevo il differenziamento trattando con 10ng/ml di PMA per 72 ore!
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ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2008 : 16:45:27
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10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA? |
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Ocean
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 09:41:10
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Citazione:
Messaggio inserito da ale83t
10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA?
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Ocean
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 09:45:09
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Citazione:
Messaggio inserito da ale83t
10 ng/ml di PMA per 72 ore? ho letto oggi in qualche articolo che alla concentrazione che dici tu (che equivale ad una 16 nM circa se non erro) facevano una incubazione di 24 ore soltanto...ma fai direttamente 72 ore o cambi il terreno dopo un tot di ore di incubazione?
In un altro protocollo, invece, ho letto che facevano incubazione di 24 ore con PMA e poi 48 ore con terreno senza PMA...che casino!
Un'ultima domanda: io poi dovrei stimolare proprio i macrofagi ottenuti con il PMA, ci può essere qualche problema o interferenza dato che teoricamente precedentemente ho già trattato con PMA?
Per il tipo di cell che ho usato (THP-1) la bibliografia consiglia 72 ore. Naturalmente ho provato ad usare tempi inferiori ma i risultati sono stati negativi. Non facevo cambi di terreno, solo dopo le 72h quando dovevo utilizzare le cell.
Anch'io, dopo differenziamento, le stimolavo con PMA: nessun problema se non una mortalità non trascurabile, ma dovuta probabilmente alla trasfezione che precedeva lo stimolo. |
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ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2008 : 11:58:51
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| ok. grazie mille per le risposte |
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Discussione |
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differenziamento monociti in macrofagi
Didattica e Relazioni
