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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 12 giugno 2008 : 15:54:06
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La prima cosa che viene da domandare - per quanto scontata - è :
sei sicuro che i primers annilino su sequenze che vengono trascritte?
(e non, magari, su introni o sequenze intergeniche)
Ovviamente devi accertarti dei siti di appaiamento
e presumo che tu conosca la sequenza del tuo cDNA.
Altra ipotesi: magari è un gene poco espresso.
Prova a caricare quantità maggiori di cDNA (aumento templato disponibile)
oppure quantità minori (riduzione della competizione)
oppure ancora aumentare il numero di cicli, entro un
limite ragionevole per non incorrere in aspecifici.
Ovviamente dovresti prendere in considerazione il fatto che
la retrotrascrizione potrebbe non essere correttamente avvenuta,
e quindi provare con un controllo positivo (di solito si usa amplificare
un gene housekeeping con oligonucleotidi standard).
Se il controllo positivo riesce, ma la tua reazione no,
allora potrebbe darsi che il programma che usi non sia
adatto (tempo di allungamento, temperatura di annealing, ecc.)
Obviously, se non riesce neanche il controllo positivo,
allora ti tocca rifare daccapo la retrotrascrizione.
P.S. hai fatto una retrotrascrizione di controllo RT-
(cioè mix identica, ma senza l'enzima) ?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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PCR sul cDNA
Didattica
