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tempo84
Nuovo Arrivato

Prov.: Verona
Citt�: san bonifacio

10 Messaggi

Inserito il - 18 giugno 2008 : 21:03:03

Il mio problema e' quello di aver un dna totale estratto da suolo (soil fastprep)sul quale � impossibile fare pcr del 16s a causa dell'elevata presenza di acidi umici.L'assorbanza con il biofotometro del rapporto 260/230 � 0,02 di media, cio' vuol dire ke i campioni contengono un elevata quantit� di questi acidi.
Secondo voi � possibile rimuoverli con una semplice precipitazione? O esiste un protocollo x eliminare questi acidi?
Chiunque abbia avuto problemi simili si faccia sentire..Graizie

tempo84
Nuovo Arrivato

Prov.: Verona
Citt�: san bonifacio

10 Messaggi

Inserito il - 20 giugno 2008 : 12:24:57

mi risp da solo visto ke ho risolto il tutto con una semplice precipitazione e lavaggio. L'assorbanza a 260/230 da 0,03 arriva a 1,4..non ancora ottimale ma molto accettabile..ora spero x la pcr..l'ho appena fatta partire

rosita84
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2008 : 01:10:14

ciao a me e' capitato di fare l'estraz da terreno e amplificare il 16s....ti consiglio di nn arrenderti subito xke' otterrai un prodotto di amplif nn molto pulito o nn avrai nulla, quindi dovrai mettere a punto i cicli di amplificazione. Ti consiglio una touchdown PCR....se poi dovrai sequenziare il tutto e' importantissimo ottenere un prodotto pulitissimo. Cmq incrociamo le dita......facci saxe

tempo84
Nuovo Arrivato

Prov.: Verona
Citt�: san bonifacio

10 Messaggi

Inserito il - 23 giugno 2008 : 09:19:53

la pcr non viene..� giorni ke provo a fare la touchdown ..le ho rpovate tutte..anke diluizioni varie..persino cn lavaggio nn vengono..questo mi sconforta un po'..sn ad un punto di stasi..

rosita84
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2008 : 02:13:32

allora prova con la touch down....ricordati di amplificare partendo da temp di annealing basse (45-50) potrebbe andar bene. Fai diversi tentativi.

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2008 : 18:14:05

Ciao!
Avevo anch'io i tuoi stessi problemi, ma su campioni compost e di monumenti.
Li ho risolti facendo delle diluizioni seriali: diluisci il templato, ma diluisci anche gli acidi umici!

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2008 : 18:16:33

Quasi dimenticavo, ma credo sia scontato...� importante che tu faccia benissimo l'estrazione e la purificazione!

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