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babbonataleincazzato
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11 Messaggi |
 Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:24:34
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Ciao a tutti,
mi è stata posta questa domanda e mi è stato assicurato che c'è una risposta logica!
faccio un clonaggio in un pUC19 che ha la selezione per l'ampicillina oltre al classico sistema di screening bianco/blu.
Il sistema delle colonie bianche e blu mi permette di distinguere i batteri trasformati che contengono il vettore con l'inserto da quelli che contengono il vettore senza inserto.
Questo però se piastro su terreno solido... ma se ho solo terreno liquido??
vi ringrazio per tutti gli spunti di riflessione che saprete darmi!
Antonio
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:33:37
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Boh.
Il massimo che puoi fare è un'analisi allo spettrofotometro
nel visibile per vedere qual'è la concentrazione di batteri
blu (che avranno un picco di assorbimento intorno a 450).
Non puoi isolare colonie monoclonali. Puoi al limite
valutare l'efficienza di ricombinazione rapportando
l'assorbana a 450 (batteri blu) con quella a 600
(batteri resistenti totali).
Altro non mi viene in mente.
Senza terreno solido non vedo possibilità di
isolare una precisa colonia, per cui ti devi
accontentare di una miscela di colonie (da
cui ricaverai una miscela di varianti di DNA).
Non puoi proprio seminarli in alcun modo? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:38:22
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no!... la semina è esclusa...
io mi stavo concentrado sui processi biochimici...
in fondo i batteri un qualcosa di diverso ce l'hanno... la presenza o meno della b-galattosidasi! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:42:28
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Beh la presenza o meno della beta-galattosidasi viene appunto
sfruttata per idrolizzare l'X-gal e dare colore: questo perchè
SI SUPPONE che tu possa seminare le colonie in modo sufficientemente
distanziato da poterle isolare una per una. Sennò a che serve?
Anche eventualmente saggiando l'attività beta-galattosidasica
totale nel tuo campione di batteri hai, ancora una volta, solo
una stima del numero di batteri ricombinanti (potresti calcolarla
come attività specifica per mg di materiale biologico, oppure
attività per ml) ma se la tua finalità è quella di ISOLARE i
cloni, allora non credo proprio che tu possa farlo senza semina!
Ma allora mi chiedo: ho capito bene qual'è il tuo fine? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 19:47:41
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si, il fine è quello di isolare batteri che abbiano un vettore con l'inserto clonato!
ti faccio un esempio: ipotizziamo che al posto dell'x-gal usassimo una sostanza che se metabolizzata è tossica per la cellula... allora i batteri che producono la b-galattosidasi (le colonie blu!) morirebbero...
è questa la strada secondo me più logica da seguire
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 20:06:01
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| Esatto babbonatale...Molto probabilmente è l'unica strada logica da seguire...Il problema è con quale sostanza fare la selezione... |
 
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 20:35:41
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francamente non ne ho la più pallida idea...
servirebbe un biochimico! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 23:08:02
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Non basta.
Scusa, in tal caso come faresti a distinguere i batteri dotati di inserto ("bianchi")
da quelli riarrangiati in modo da essere resistenti ma non alfa-complementati?
Secondo me è inutile: senza l'isolamento dei cloni non si può clonare! |
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2008 : 23:59:32
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gli alfa complementati li selezioni con l'ampicillina...
mi è venuto in mente un altro sistema... mettere nel polylinker un marcatore selettivo negativo così i vettori senza inserto vengono persi per azione di questo marcatore quelli con l'inserto sopravvivono...
suggerimenti su cosa possa selezionare negativamente un E. coli? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 00:17:02
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Non hai capito: ci saranno sicuramente cloni riarrangiati
che hanno 'rubato' la resistenza dell'ampicillina ma non
complementano e probabilmente non hanno neppure l'inserto
(per non parlare dei cloni mutati...)
Se non li isoli subito, te li porti sempre dietro!
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 11:43:51
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quelli li hai anche su terreno solido!
il problema non è isolare il clone... a quello non ci arriverai mai! ma isolare i batteri che hanno un vettore riarrangiato... sarà cmq una popolazione di batteri diversi tra di loro! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 11:45:30
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Ok.  Direi che hai un'idea molto distorta del clonaggio.... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 11:59:14
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Dai, provo a farti un po' di chiarezza:
-Avere un vettore riarrangiato NON è un bene!! non devi cercare cloni che ce
l'abbiano, devi semmai escluderli!!
- Su terreno solido "li hai" , certo, ma facendo uno screening colonia
per colonia (screening di restrizione, screnning tramite PCR colony, ecc.)
puoi riconoscerli subito ed escluderli, scegliendo solo le colonie che
hanno TUTTO il vettore e TUTTO l'inserto.
- Non è assolutamente vero che "non ci arriverai mai" ad avere un clone,
ci arriverai soltanto se riuscirai a diluire sufficientemente delle singole
unità replicanti (=clonali) per distinguere le colonie separate.
A questo, non ad altro, serve il terreno solido.
In una miscela di trasformazione avrai almeno 4 diverse
possibilità, che potranno presentarsi con una frequenza
statistica diversa da caso a caso:
1> Batteri che non hanno preso nulla --> morte per selezione negativa in amp
2> Batteri che hanno preso il plasmide richiuso --> alfa-complementati --> blu
3> Batteri che hanno preso il plasmide con l'inserto --> NON alfa-complementati--> bianchi
4> Batteri che hanno preso PEZZI di plasmide (sono molto più frequenti di quello che immagini)
- riarrangiamento plasmidico comprendente ampR --> sopravvivono e sono bianchi!
- riarrangiamento plasmidico comprendente ampR e beta-gal --> sopravvivono e sono blu!
--> inutili, perchè non hanno l'inserto e probabilmente potrebbero
inficiare in utilizzi successivi del DNA plasmidico, rendendolo inutilizzabile!
5> Batteri che hanno preso tutto, ma hanno mutazioni puntiformi
---> anch'essi dannosi per il tuo prodotto plasmidico complessivo
A questo punto dovrebbero (spero) esserti chiaro che isolare una popolazione di batteri
diversi tra loro NON HA ALCUNO SCOPO PRATICO: qualsiasi metodo inventerai per separare
i blu dai bianchi, non ti porterà ad alcun miglioramento dell qualità della popolazione
batterica, perchè NON è detto che l'evento che ho indicato con "2" sia l'evento
statisticamente preponderante... non so se mi sono (finalmente) spiegato. |
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babbonataleincazzato
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 19:19:47
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ti ringrazio per la lezione sul clonaggio!
ti ricordo però che questa non è una situazione reale perchè appunto, farsi un terreno solido LB+agar non ci vuole assolutamente niente.
la domanda iniziale era: esiste un sistema per distinguere colonie bianche da quelle blu in un terreno liquido? la riposta è si! evidentemente perchè, indipendentemente dai casi che tu citi al punto 4, esistono altre caratteristiche che ti permettono di fare una selezione! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 19:32:51
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Di lezioni di simpatia però non c'hai bisogno vedo 
Citazione:
indipendentemente dai casi che tu citi al punto 4, esistono altre caratteristiche che ti permettono di fare una selezione!
 niente ...ci rinuncio.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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